sobre o uso do kit de reagentes
para extração de DNA de material biológico
"DNA-sorb-S-M"
AmpliSense
FBUN Instituto Central de Pesquisa de Epidemiologia
Rospotrebnadzor,
Apenas para pesquisa
Federação Russa, 111123,
e outros fins não médicos
Moscou, rua Novogireevskaya, 3A
LISTA DE ABREVIAÇÕES
PROPÓSITO
PRINCÍPIO DO MÉTODO
FORMAS DE EMBALAGEM
EXTRAÇÃO DE DNA DE MATERIAL BIOLÓGICO DE ANIMAIS........................... 8
ALIMENTOS ANIMAIS OU PLANTASSÍMBOLOS UTILIZADOS EM PRODUTOS IMPRESSOS
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 2 de 15
As seguintes abreviações e símbolos são usados neste manual:
DNA - ácido desoxirribonucléico NA - ácidos nucléicos TC - controle de extração negativo NCO - amostra de controle negativo PC - controle de extração positiva PKO - amostra de controle positivo PCR - reação em cadeia da polimerase
- Federal organização financiada pelo estado Ciência
A extração de DNA é um procedimento pré-analítico do método de PCR.
Volume da amostra para extração: 100 µl (podem ser testadas amostras com um volume de 10 a 100 µl ou um peso de 10 a 100 mg)1.
ATENÇÃO! Para obter informações sobre o procedimento de coleta, condições de transporte e armazenamento do material de teste, necessidade e procedimento de preparo para extração de DNA, bem como informações sobre substâncias interferentes e restrições associadas à amostra, consulte as instruções do kit de reagente de amplificação utilizado .
Para alguns tipos de material biológico, é necessária uma etapa de preparação da amostra. Cm.
instruções para o kit de reagente de amplificação usado.
Formulário 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 3 de 15 por centrifugação e posterior lavagem do sorvente. Quando o tampão de eluição é adicionado ao sorvente, o NC passa da superfície da sílica para a solução, que é separada das partículas do sorvente por centrifugação. Como resultado desse procedimento, obtém-se uma preparação de NA altamente purificada, livre de inibidores da reação de amplificação, o que garante alta sensibilidade analítica do estudo de PCR.
O kit de reagentes está disponível em 2 configurações:
A Forma 1 inclui um conjunto de reagentes "DNA-sorb-S-M" opção 50.
A Forma 2 inclui um conjunto de reagentes "DNA-sorb-S-M" versão 100.
Ao estudar produtos alimentícios, aditivos biológicos, ração animal ou matérias-primas vegetais, o trabalho deve ser realizado de acordo com os requisitos das diretrizes MU 1.3.2569-09 “Organização do trabalho de laboratórios que utilizam métodos de amplificação de ácidos nucleicos ao trabalhar com material contendo microrganismos dos grupos de patogenicidade I–IV "e GOST R 53214-2008" Produtos alimentícios. Métodos de análise para detecção genética organismos modificados e produtos deles derivados.
Requisitos gerais e definições”.
Ao trabalhar, você deve sempre cumprir os seguintes requisitos:
– O processo de laboratório deve ser unidirecional. A análise é realizada em salas separadas (zonas). O trabalho deve começar na Zona de Extração e continuar na Zona de Amplificação e Detecção. Não devolva amostras, equipamentos e reagentes à área onde a etapa anterior do processo foi realizada.
– Reagentes não utilizados, reagentes com expirado e Formulário 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 4 de 15 reagentes usados, embalagens3, material biológico, incluindo materiais, instrumentos e objetos contaminados com material biológico, devem ser descartados de acordo com os requisitos da SanPiN 2.1.7.2790-10 "Requisitos sanitários e epidemiológicos para o gerenciamento de resíduos hospitalares".
– Use e troque a cada operação ponteiras descartáveis para pipetas automáticas com filtro4. Utensílios plásticos descartáveis devem ser jogados em um recipiente especial contendo um desinfetante que possa ser usado para descontaminar o lixo médico.
– Utensílios (almofarizes e pilões) e instrumentos de metal (bisturis, tesouras, pinças, acessórios de liquidificador, etc.) usados para preparação de amostras são mantidos em uma solução desinfetante (por exemplo, solução salina de ácido dicloroisocianúrico a 0,2%) dentro de uma hora, lave água da torneira com detergentes tensoativos e, após lavagem em água corrente e deionizada, secar em estufa seca por 4 horas à temperatura de 180 C.
– O kit de reagentes destina-se a uma única utilização para testar o número especificado de amostras (consulte a secção "Composição").
– O kit de reagentes está pronto para uso de acordo com estas instruções.
Use o kit de reagente estritamente para o fim a que se destina.
– Não use o kit de reagentes se a embalagem interna estiver quebrada ou aparência reagente não corresponde à descrição.
– Não utilize o kit de reagentes se as condições de transporte e armazenamento de acordo com as instruções não forem observadas.
Reagentes não utilizados, reagentes vencidos, reagentes usados e embalagens são classificados como classe G de risco de resíduos médicos.
Pontas descartáveis sem filtro são usadas para remover o sobrenadante durante a extração com um aspirador a vácuo.
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 5 de 15
– Não utilize o kit de reagentes após o prazo de validade.
– Use luvas descartáveis sem pó, jalecos e proteção para os olhos ao manusear amostras e reagentes. Lavar bem as mãos no final do trabalho. Todas as operações são realizadas apenas com luvas para evitar o contato com o corpo humano.
– Evite a inalação de vapores, contato com a pele, olhos e mucosas, não engula. Em caso de contato, lave imediatamente a área afetada com água; se necessário, consulte um médico. cuidados médicos.
– As fichas de dados de segurança do reagente (SDS) estão disponíveis mediante solicitação.
Avaliação de eventos prováveis, como resultado dos quais podem ocorrer consequências negativas para o corpo humano:
Quando usado para o fim a que se destina e seguindo as precauções acima, o contato com o corpo humano é excluído.
No situações de emergência o seguinte é possível:
- irritação da membrana mucosa dos olhos em pessoas sensíveis,
– irritação da pele em pessoas sensíveis,
- reação alérgica,
- danos por inalação,
- prejudicar quando tomado por via oral.
Efeitos específicos do kit de reagentes no corpo humano:
- Sem efeito cancerígeno.
- Não há efeito mutagênico.
– Sem toxicidade reprodutiva.
1. Parafuso de polipropileno descartável de 1,5 ml e 5,0 ml ou tubos de rolha hermética (por exemplo, Axygen, Inc.
(Exgen, Inc.), EUA, ou equivalente).
2. Pontas descartáveis para pipetas de volume variável com filtro de até 200 e até 1000 µl (por exemplo, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EUA, ou similar).
3. Ponteiras descartáveis para pipetas de volume variável de até 200 µl (por exemplo, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EUA ou similar).
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 6 de 15
4. Racks de tubos de 1,5 ml (por exemplo, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EUA ou similar).
5. Caixa laminar, classe de segurança biológica II tipo A (por exemplo, "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Rússia ou similar).
6. Termostato para tubos tipo "Eppendorf" de 25 a 100 °C (por exemplo, SIA Biosan, Letônia ou similar).
7. Agitador termostato para tubos tipo Eppendorf de 25 a 100 °C (por exemplo, TS-100, SIA Biosan, Letônia ou similar).
8. Microcentrífuga para tubos de ensaio tipo "Eppendorf" com velocidade máxima centrifugação de pelo menos 12 mil g (por exemplo, MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany ou similar).
9. Vortex (por exemplo, SIA Biosan, Letônia ou similar).
10. Aspirador a vácuo médico com um frasco coletor para remover o sobrenadante (por exemplo, OM-1, OOO Utes, Rússia ou similar).
11. Dispensadores automáticos de volume variável (por exemplo, Biohit LLC, Rússia ou similar).
12. Geladeira de 2 a 8 °С com freezer de menos 24 a menos 16 С.
13. Um roupão separado, gorros, sapatos e luvas descartáveis de acordo com MU 1.3.2569-09.
14. Descartável recipientes de plástico para liberação e inativação de materiais.
– – –
2. Selecione o número necessário de tubos de polipropileno descartáveis de 1,5 ml com tampas de rosca ou tampas herméticas (incluindo controles de extração negativos e positivos, se forem fornecidos para o estudo de PCR).
Ao armazenar o tampão de lise e a solução de lavagem 1 a uma temperatura de 2 a 8°C, pode formar-se um precipitado na forma de cristais.
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 8 de 15
3. Adicione 10 µl de VKO6 a cada tubo (se for fornecido para teste de PCR). Adicione 400 µl de tampão de lise e 17 µl de tampão de lise aos tubos.
4. Dispense 100 µl de amostras de teste6 em tubos preparados, usando uma ponta de filtro separada para cada amostra.
ATENÇÃO! 400 µl de tampão de lise e 17 µl de reagente de lise podem ser adicionados ao tubo com a quantidade necessária de amostra de teste e 10 µl de BKO7 (se fornecido para o estudo de PCR) podem ser adicionados ao mesmo tubo usando pontas de filtro separadas.
5. Adicione 100 µl de OKO ao tubo de extração de controle negativo (TC), adicione 90 µl de OKO e 10 µl de FKO ao tubo de extração de controle positivo (PC) (se controles de extração forem fornecidos para conduzir estudos de PCR).6
6. Feche bem as tampas, misture bem e agite as gotas no vórtex.
Coloque os tubos em um termostato a 64°C por 1 hora, agitando periodicamente no vórtex (5 vezes a cada 10-12 min). A incubação é permitida durante 12 horas a 60 °C.
7. Sedimente as partículas de amostra não dissolvidas por centrifugação por 5 min a 10 kg (por exemplo, 12 krpm para microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
8. Remova o sobrenadante em um volume de 200-350 µl com muito cuidado (evitando a entrada de partículas suspensas e gotas de gordura) com pontas separadas com filtros e transfira para novos tubos de ensaio. Decantando as gotas no vórtice.
9. Ressuspenda o sorvente universal misturando-o intensamente em um vórtice. Adicione 25 µl de sorvente universal ressuspenso a cada tubo com uma ponta separada e feche bem as tampas.
Vortex, deixe em um rack por 10 minutos, mexendo a cada 2 minutos.
É permitido alterar o volume das amostras de teste e controle, consulte as instruções do kit de reagente de amplificação utilizado.
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 9 de 15
18. Repita o procedimento de lavagem, parágrafos seguintes. 15–16, remova o sobrenadante completamente.
19. Coloque os tubos de ensaio com as tampas abertas em um termostato a 64 °C por 5 a 10 minutos para secar o sorvente universal.
20. Adicione 50–100 µl de tampão de eluição B aos tubos (consulte as instruções do kit de reagente de amplificação utilizado).
Vortex até que o sorvente esteja completamente ressuspenso. Coloque em um termostato com temperatura de 64 °C por 5 a 10 minutos, mexendo periodicamente (1 vez por minuto) em um vórtice.
O ADN purificado pode ser armazenado a uma temperatura de 2 a 8 °C durante uma semana, a uma temperatura de 24 a 16 °C negativos durante 6 meses e a uma temperatura não superior a 68 °C negativos durante um ano. Para isso, é necessário, sem capturar o sorvente, transferir o sobrenadante para um novo tubo de ensaio.
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 10 de 15
1. Aqueça o tampão de lise e a solução de lavagem 1, se armazenado entre 2 e 8°C, a 64°C até que os cristais estejam completamente dissolvidos.
2. Coloque tubos de 1,5 ml com amostras de teste pré-tratadas em um rack (consulte as instruções do kit de reagente de amplificação usado para volume/quantidade de amostra).
3. Prepare um tubo de polipropileno descartável de 1,5 ml com uma tampa de rosca ou um controle de extração negativo (CE) bem ajustado. Adicione 100 µl de OKO ao tubo de ensaio.
4. Adicione 400 µl de tampão de lise e 17 µl de reagente de lise aos tubos de teste e OCs.
5. Feche bem as tampas, misture bem e agite as gotas no vórtice.
Coloque os tubos de ensaio em um termostato a uma temperatura de 64 °C por 1 hora, agitando periodicamente no vórtice (5 vezes a cada 10-12 min) ou use um agitador de termostato.
6. Sedimente as partículas de amostra não dissolvidas por centrifugação por 5 min a 10 kg (por exemplo, 12 krpm para microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
7. Selecione o número necessário de novos tubos de polipropileno descartáveis de 1,5 ml com tampas de rosca ou tampas herméticas.
8. Ressuspenda o sorvente universal misturando-o intensamente em um vórtice. Adicione 25 µl de sorvente universal ressuspenso a cada tubo com uma ponta separada e feche bem as tampas.
9. Dos tubos com amostras lisadas, remova o líquido sobrenadante em um volume de 200–350 µl com muito cuidado (evitando a entrada de partículas suspensas e gotas de gordura) usando ponteiras separadas com filtros e transfira para tubos com sorvente. Vortex, deixe em um rack por 10 minutos, mexendo a cada 2 minutos.
Formulário 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 11 de 15
10. Centrifugue os tubos em uma microcentrífuga por 1 min a 2 kg (por exemplo, 5 krpm para microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
11. Sem segurar o sorvente, remova o sobrenadante de cada tubo com uma ponta separada de 200 µl sem filtro usando um aspirador a vácuo.
12. Adicione 300 µl da solução de lavagem 1 aos tubos, feche bem as tampas e agite no vórtice até que o sorvente universal esteja completamente ressuspenso.
13. Centrifugue os tubos em uma microcentrífuga por 1 min a 2.000 g.
14. Sem segurar o sorvente, remova o sobrenadante de cada tubo com uma ponta separada de 200 µl sem filtro usando um aspirador a vácuo.
15. Adicione 500 µl da solução de lavagem 2 aos tubos, feche bem as tampas, misture em vórtice até que o sorvente universal esteja completamente ressuspenso
16. Centrifugue os tubos em uma microcentrífuga por 1 min a 7 kg (por exemplo, 10 krpm para uma microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
17. Sem segurar o sorvente, remova o sobrenadante de cada tubo com uma ponta separada de 200 µl sem filtro usando um aspirador a vácuo.
18. Repita o procedimento de lavagem, parágrafos seguintes. 15-16, remova o sobrenadante completamente.
19. Coloque os tubos de ensaio com as tampas abertas em um termostato com temperatura de 64 °C por 5-10 minutos para secar o sorvente universal.
20. Adicione aos tubos 50 µl de tampão de eluição B. Vortex até que o sorvente esteja completamente ressuspenso. Coloque em um termostato com temperatura de 64 °C por 5 a 10 minutos, mexendo periodicamente (1 vez por minuto) em um vórtice.
21. Centrifugar os tubos em microcentrífuga por 1 min a 10 mil g. O sobrenadante contém DNA purificado. As amostras estão prontas para PCR.
O DNA purificado pode ser armazenado a uma temperatura de 2 a 8 °C por uma semana, a uma temperatura de -24 a -16 °C por 6 meses e a uma temperatura Forma 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / página 12 de 15 não superior a menos 68 °С durante o ano. Para isso, é necessário, sem capturar o sorvente, transferir o sobrenadante para um novo tubo de ensaio.
Transporte. Um conjunto de reagentes deve ser transportado em temperatura de 2 a 8 C por no máximo 5 dias em recipientes térmicos contendo bolsas de gelo por todos os tipos de veículos cobertos. Ao receber, desmonte de acordo com as temperaturas de armazenamento especificadas.
Armazenar. Armazene o kit de reagentes a uma temperatura de 2 a 25 C, exceto o reagente de lise. Armazene o reagente de lise em uma geladeira a uma temperatura de 2 a 8 C.
As câmaras frigoríficas devem fornecer um regime de temperatura regulado.
O método rápido de extração de DNA em microcolunas foi desenvolvido para isolar DNA total de sangue, plasma, saliva, urina, culturas de células e qualquer aglomerado de células em tampão. A alta pureza do DNA isolado permite que ele seja utilizado para todos os tipos de análises.
o tempo de isolamento é de 30 a 45 minutos dependendo do número de amostras;
Utilizando kits para extração de DNA genômico da série DNA-Extran, é possível isolar DNA de diversos materiais biológicos: sangue, culturas de células bacterianas e animais, tecidos frescos, congelados ou secos de animais e plantas.
Adaptado para isolamento de DNA de micobactérias de escarro, lavagens brônquicas, líquido cefalorraquidiano, exsudato, puntiforme, biópsia, urina, secreções do trato genital, culturas de células. O processamento preliminar do material clínico é realizado de acordo com os procedimentos padrão para preparação de amostras em estudos microbiológicos (Ordem nº 109 do Ministério da Saúde da Federação Russa de 21 de março de 2003 "Ao melhorar Federação Russa”, Apêndice 11 “Instrução sobre métodos unificados de pesquisa microbiológica na detecção, diagnóstico e tratamento da tuberculose”). Para inativar o material clínico, recomendamos o uso de nossa solução inativadora A.
A solução A mata as micobactérias em 12 horas e desinfeta o material clínico que pode ser usado para análises posteriores (extração de DNA, PCR, etc.). A solução A é adaptada especificamente para o tratamento de escarro e substitui completamente o procedimento padrão usando solução NaOH-NALC, possui propriedades mucolíticas excepcionais. A solução de inativação A aumenta o rendimento do DNA em comparação com a preparação de amostra NaOH-NALC padrão.
O procedimento de isolamento inclui: lise do DNA com isotiocianato de guanidina, sorção do DNA em partículas magnéticas, sedimentação do DNA por centrifugação, etapas de lavagem e eluição do DNA. Pode ser usado para isolar o DNA de outros microorganismos.
o uso de partículas magnéticas revestidas de sílica gel como sorvente é um formato tecnologicamente mais avançado e conveniente em comparação com outros sorventes, permite a máxima padronização e automação do procedimento de extração de DNA;
um controle positivo interno (IPC) é adicionado a cada amostra de teste, a presença/ausência de inibidores de RT-PCR e a eficiência da extração de DNA são julgadas pela reação de amplificação de IPC.
Os kits de reagentes "Sorb-GMO-A" e "Sorb-GMO-B" são projetados especificamente para extração de DNA de materiais vegetais, alimentos e rações. Ambos os kits de purificação de DNA usam sorvente de silício. "Sorb-GMO-A" contém cloreto de guanidina como agente de lise, "Sorb-GMO-B" contém um detergente iônico STAB, que fornece o rendimento máximo de DNA de componentes vegetais. Características distintas do kit "Sorb-GMO-A" são a rapidez na extração do DNA e a ausência de clorofórmio, o que torna o trabalho com o kit mais seguro.
Projetado para isolar o DNA da Legionella de corpos d'água meio Ambiente(torres de resfriamento, piscinas, parques aquáticos, sistemas de abastecimento de água quente e fria). A concentração mínima recuperada de Legionella é de 100 células por 0,5 L de amostra.
O conjunto "M-Sorb-Leg" é produzido em duas modificações: "M-Sorb-Leg1000" para amostras de água com volume de 1-1000 ml e "M-Sorb-Leg1" para amostras de água de até 1 ml. O conjunto M-Sorb-Leg1000 prevê a filtragem da água usando um filtro de policarbonato.
um conjunto de reagentes "M-Sorb-Leg" permite eliminar os inibidores de PCR presentes em amostras de água altamente contaminadas;
O kit de reagentes M-Sorb-OOM foi desenvolvido para isolar o DNA de objetos ambientais (solo, água, cadáveres de animais, etc.) suspeitos de estarem infectados com microorganismos altamente perigosos (OOM), a fim de prepará-los para análise posterior por PCR de tempo. O procedimento de extração é semelhante ao descrito para o conjunto M-Sorb-Leg.
O kit destina-se ao isolamento de ARN do sangue, fragmentos de tecido, culturas de células. O RNA obtido com o kit RNA-Extran pode ser utilizado tanto para RT-PCR quanto para análise de hibridização, tradução in vitro e clonagem.
O princípio do isolamento do RNA é baseado na extração de fenol ácido de acordo com Chomchinsky, em que apenas o RNA permanece na fase aquosa, e o DNA em combinação com as proteínas passa para a fase orgânica. O tiocianato de guanidina é usado como um agente que isola e desnatura nucleases celulares.
permite obter RNA altamente purificado, livre de impurezas de DNA;
fornece extração completa de RNA de sangue total, fragmentos de tecido e culturas de células;
permite obter RNA intacto;
| Catálogo de número | título | número de reações |
| EX-509 | Kit de reagentes “DNA-Extra-1” para isolamento de DNA genômico de sangue total | 100 |
| EX-511 | Kit de reagentes “DNA-Extran-2” para extração de DNA de tecidos animais e humanos | 100 |
| EX-512 | Kit de reagentes “DNA-Extran-3” para extração de DNA de culturas bacterianas | 100 |
| EX-513 | Kit de reagentes “DNA-Extra-4” para extração de DNA de tecidos vegetais | 100 |
| EX-514 | Kit de reagentes “K-Sorb” para isolamento de DNA total em colunas (de sangue, saliva, urina, culturas de células, raspagens de células epiteliais) | 100 |
| EX-515 | Kit de reagentes "RNA-Extra" para isolamento de RNA de sangue, tecidos, culturas de células | 50 |
| OM-505 | Kit de reagentes “M-Sorb-Tub” para extração de DNA de amostras clínicas e culturas celulares (em partículas magnéticas) | 50 ou 100 |
| GM-502-50 | “SORB-GMO-A” (guanidina + sorvente) Um conjunto de reagentes para extração de DNA de matérias-primas vegetais e produtos alimentícios | 50 |
| GM-503-50 | “SORB-GMO-B” (CTAB + sorvente) Um conjunto de reagentes para extração de DNA de matérias-primas vegetais e produtos alimentícios | 50 |
| OM-506 | Kit de reagentes “M-Sorb-Leg1000” para isolamento de DNA de legionella de amostras de água de até 1000 ml (em partículas magnéticas, os filtros são fornecidos separadamente) | 50 ou 100 |
| OM-507 | Kit de reagentes “M-Sorb-Leg1” para isolamento de DNA de legionella de amostras de água até 1 ml (em partículas magnéticas) | 50 ou 100 |
| OOM-502 | Kit de reagentes “M-sorb-OOM” para extração de DNA de objetos ambientais (em partículas magnéticas) | 50 ou 100 |
| Nome | Volume | Produção | Método | Cat.Número |
|---|---|---|---|---|
| “GMO-MagnoSorb” (guanidina + sorvente magnético) Um conjunto de reagentes para extração de DNA de matérias-primas vegetais e produtos alimentícios | 50 secreções | Synthol | PCR em tempo real | GM-505-50 |
| “SORB-GMO-A” (guanidina + sorvente) Um conjunto de reagentes para extração de DNA de matérias-primas vegetais e produtos alimentícios | 50 | Synthol | PCR em tempo real | GM-502-50-50 |
| “SORB-GMO-B” (CTAB + sorvente) Um conjunto de reagentes para extração de DNA de matérias-primas vegetais e produtos alimentícios | 50 | Synthol | PCR em tempo real | GM-503-50-50 |
| Conjunto de reagentes “Amplitub-RV” kit nº 1 (“M-Sorb-Tub“) para o isolamento de DNA de micobactérias de amostras clínicas e culturas celulares (em partículas magnéticas) | 50 | Synthol | PCR em tempo real | OM-505 |
| Kit de reagentes “DNA-Extra-1” para isolamento de DNA genômico de sangue total | 100 | Synthol | PCR em tempo real | EX-509-100 |
| Kit de reagentes “DNA-Extran-2” para extração de DNA de tecidos animais e humanos | 100 | Synthol | PCR em tempo real | EX-511 |
| Kit de reagentes “DNA-Extran-3” para extração de DNA de culturas bacterianas | 100 | Synthol | PCR em tempo real | EX-512-100 |
| Kit de reagentes “DNA-Extran-3” para extração de DNA de tecidos vegetais | 100 | Synthol | PCR em tempo real | EX-513-100 |
| Kit de reagentes “K-Sorb” para isolamento de DNA total em colunas (de sangue, saliva, urina, culturas de células, raspagens de células epiteliais) | 100 | Synthol | PCR em tempo real | EX-514-100 |
| 48 reações | Synthol | PCR em tempo real | GM-443-48 | |
| Kit de reagente de triagem de soja/35S+FMV/NOS | 50 reações | Synthol | PCR em tempo real | GM-416-50 |
Solução de lise 30 cm 3 ,
Solução de lavagem 1 30 cm 3 ,
Concentrado para solução de limpeza 2 20 cm 3 ,
Suspensão absorvente 2 cm 3,
Tampão de eluição de DNA 4 cm 3 .
Prepare a solução de lavagem 2, para isso, misture 20 cm 3 do concentrado do kit, 80 cm 3 de água destilada e 100 cm 3 de etanol 96% em um frasco separado. Armazene a solução em temperatura ambiente em um frasco bem fechado.
Verifique o estado do sorvente - ao assentar, deve ocupar aproximadamente metade do volume da suspensão.
Em um tubo de polipropileno de 1,5 cm 3 bem fechado (de preferência com tampa de rosca), adicione 100 µl de uma amostra de teste previamente preparada, negativa ou positiva, adicione 300 µl de solução de lise (a cada amostra com uma ponta separada) e misture bem pipetando 3-10 vezes.
Adicione 15 - 20 µl do sorvente ressuspenso, misture bem em um vórtice, coloque em um rack por 5-7 minutos para sedimentação completa do sorvente.
Sedimentar o sorvente em uma microcentrífuga por 30 segundos a 3-8 mil rpm. Pegue o sobrenadante de cada tubo com uma ponta separada (é conveniente usar uma sucção a vácuo).
Adicione 300 μl da solução de lavagem 1, misture em vórtice até que o sorvente esteja completamente ressuspenso (se o sorvente quebrar mal, quebre com uma pipeta), precipite em uma centrífuga a 4-8 mil rpm por 30 seg. Retire o sobrenadante de cada tubo com uma ponta separada.
Adicione 800 μl da solução de lavagem 2, misture em vórtex até que o sorvente esteja completamente ressuspenso, precipite em uma microcentrífuga a 6-10 mil rpm por 30 seg, pegue o sobrenadante.
Repita a etapa 6, selecione cuidadosamente o sobrenadante, seque o precipitado sorvente em um termostato a 65 ° C por 5 min.
Ressuspenda o sorvente em 30–40 µl de tampão de eluição, coloque em um termostato a 65°C por 5 min, agitando periodicamente no vórtex.
Sedimento em uma microcentrífuga a uma velocidade máxima de 1 min.
A amostra está pronta para PCR, o sobrenadante contém DNA purificado.
Como controle negativo na etapa de extração do DNA, é necessário o uso de soro fisiológico ou água deionizada.
A eficiência da extração de DNA usando o kit DNA-sorb-PCR é de 30 a 60%.
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material clínico |
plasma, soro |
Raspagem, sêmen, lavagens faríngeas, urina |
Biópsia, sangue, fezes |
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Número de pipetagens | |||
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volume absorvente | |||
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Taxa de sedimentação sorvente |
8 mil rpm |
6 mil rpm |
3-4 mil rpm |
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Volume do eluente | |||
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Eficiência de extração de DNA |
Tampão de reação 5x. 1000 µl (solução viscosa de azul claro)
Água deionizada. 2000 µl
Mistura de nucleotídeos. 500 µl
Taq polimerase.100 µl
Mistura de primers. 500 µl
Cera para PCR. 2000 µl
Controle positivo. 100 µl
Controle negativo 100 µl
Óleo mineral 4000 µl
O kit é armazenado a menos 20°C por um ano.
