Aula 12
MUTAGÊNESE ESPONTÂNEA E INDUZIDA
Existem dois tipos de mutagénese, dependendo da natureza deste fenómeno. Um é determinado pela complexidade dos processos biológicos bioquímicos e moleculares na célula, o outro é determinado pelos fatores externos do ambiente no qual o organismo se desenvolve e desempenha funções vitais.
MUDANÇAS PRÉ-MUTACIONAIS NO MATERIAL GENÉTICO
Os padrões de variabilidade ainda não são bem compreendidos. Muitas vezes não sabemos quando e em qual gene ocorrerá uma mutação, qual característica será alterada, se a mutação será prejudicial ou benéfica ao organismo.
Por outro lado, vamos lembrar de um curso de bioquímica que as células possuem um sistema especial de reparo enzimático que corrige os erros de replicação e, assim, reduz a taxa de erro para 10–8 – 10–10. No entanto, levando em consideração as características dos organismos, podemos dizer que quanto maior o genoma, potencialmente maior número de mutações espontâneas ou induzidas podem ser formadas nele. Foi demonstrado que a mutagênese ocorre mesmo em sementes secas e células dormentes, o que pode ser devido ao fato de o DNA desses biossistemas estar na forma A.
Falando em mudanças pré-mutações, vale lembrar que na verdade são mutações que existem por um tempo limitado, durante o qual as enzimas de reparo têm tempo para corrigi-las. E apenas uma pequena parte dessas mudanças se transforma em verdadeiras mutações. A ação de um fator adicional (mesmo não mutagênico, por exemplo, temperatura) pode levar ao aumento do número de mutações observadas, pois esse fator atrapalha o trabalho das enzimas de reparo. Tal fenômeno foi demonstrado, por exemplo, para a mosca Drosophila, na qual o número de mutações aumentava significativamente se, após a irradiação com raios X, elas fossem adicionalmente expostas a temperaturas elevadas. O fenômeno é chamado de EFEITO EFEITO. Ao mesmo tempo, não se deve esquecer que as mutações aparecem nas gerações subseqüentes.
Em conclusão, deve-se notar que, embora o estudo da mutagênese por engenharia genética seja um passo importante, não elimina a necessidade de estudar as regularidades do processo de mutação ao nível de uma célula ou de um organismo inteiro.
No tópico anterior, falamos sobre o fato de que as mutações são baseadas em mudanças nos nucleotídeos, e o processo de mutação em diferentes partes dos cromossomos (DNA) pode ocorrer com velocidade diferente, que depende em grande parte da presença de bases nitrogenadas metiladas ali. Considerando o processo de mutação em relação a organismos inteiros, deve-se dizer que para cada espécie de animal, planta ou bactéria, a frequência de ocorrência de mutações e a direção da mutação são diferentes. Essas diferenças se devem à influência de muitos fatores: as características genotípicas das espécies, o grau de adaptação às condições ambientais, a força dos fatores naturais, etc.
Por exemplo, ao estudar o processo de mutação em Drosophila, verificou-se que em todo o organismo, tendo em conta as visíveis, bem como várias pequenas mutações, verifica-se que cerca de 5% dos gametas adquirem novas mutações em cada geração. Com relação aos cromossomos individuais, verificou-se que mutações letais ocorrem no cromossomo sexual X com uma frequência de 0,15% por geração, e a ocorrência de mutações no segundo cromossomo ocorre com uma frequência de cerca de 0,5%.
A mutabilidade diferente de genes individuais também foi revelada. Por exemplo, no milho, esse indicador para o gene da cor vermelha aleurona é de 1,1 por 100 mil gametas, e para o gene que fornece a síntese do pigmento antocianina é de 182 por 100 mil gametas.
Foi observado que genes semelhantes em genótipos diferentes sofrem mutações em taxas diferentes.
O material experimental acumulado sugere que a mutação genética espontânea até certo ponto depende de mudanças fisiológicas e bioquímicas na célula causadas por fatores externos. Ao mesmo tempo, o aparecimento de mutações naturais (espontâneas) em microorganismos não requer de forma alguma o contato da célula com o fator em relação ao qual podem surgir mutações que fornecem suas reações adaptativas.
Mutações espontâneas em humanos são amplamente representadas. Assim, para 1 milhão de gametas formados, existem cerca de 400 portadores de mutações para talassemia, 70 para condrodistrofia, 28 para albinismo e daltonismo e 32 para hemofilia.
Os fatores do processo de mutação natural devem incluir não apenas erros no processo de replicação, transcrição e tradução, mas também aqueles que podem ser causados por alterações nos processos fisiológicos e bioquímicos da célula (por exemplo, formação aumentada de peróxido de hidrogênio ou outras substâncias de efeito semelhante). Ao mesmo tempo, os fatores ambientais parecem ser a BASE para o aparecimento de mutações naturais.
Até recentemente, o papel dominante nesse processo era atribuído ao fundo de radiação natural, que consiste em raios cósmicos, radiação terrestre e a ação de isótopos radioativos que entram no corpo de fora, incl. com alimentos (por exemplo, Ra, 40 K, etc.). O valor deste fundo é 0,12-0,23 rad por ano.
O efeito da radiação em organismos com ciclos de vida curtos pode ser pequeno. Mas em humanos, durante a ontogênese, até 25% do número total de mutações pode ocorrer precisamente sob a influência do fundo radioativo natural. As plantas que vivem até mil anos ou mais (por exemplo, as sequóias) podem ser ainda mais afetadas por esse fator.
O estudo do problema descrito levou à descoberta de substâncias específicas - antimutagênicos, proporcionando uma espécie de proteção dos organismos desse fator, bem como de outros mecanismos associados à regulação do processo de mutação como um todo. Em primeiro lugar, trata-se da descoberta de genes mutadores que aumentam o processo mutagênico em certas regiões dos cromossomos em 1 a 2 mil vezes, o que se deve em parte a uma mudança no mecanismo de ação de uma das enzimas centrais da replicação do DNA - DNA polimerase. Também é mostrado o funcionamento do gene antimutador, que regula a atividade da enzima especificada e, assim, reduz o número de mutações que ocorrem durante a replicação. Mecanismos de ação semelhantes dos genes descritos também foram demonstrados para outras proteínas e enzimas envolvidas no processo de replicação do DNA: DNA ligase, proteínas de ligação ao DNA e outras proteínas.
Verificou-se também que a formação de mutações pode ser bloqueada geneticamente da mesma forma que qualquer outro processo fisiológico. Por exemplo, uma alteração nos genes lex A ou rec A na bactéria E. coli leva à supressão parcial ou completa do processo de mutação sob a influência de radiação ionizante, luz ultravioleta ou alguns agentes químicos mutagênicos.
MUTAGÊNESE INDUZIDA
Por processo mutacional induzido entende-se a ocorrência de alterações hereditárias sob a influência da influência dirigida de fatores do meio externo ou interno. As alterações são resultado de processos fisiológicos complexos da célula, que se baseiam em reações químicas e físico-químicas.
Os primeiros resultados nesse sentido foram obtidos no início do século XX. Ao mesmo tempo, o maior sucesso foi obtido no estudo do efeito das radiações ionizantes, que eram os principais objetos de pesquisa dos físicos da época.
A descoberta por Nadson e Filippov em 1925 da ação mutagênica dos raios de rádio durante o tratamento de células de levedura iniciou a era da mutagênese induzida. No entanto, o fundador dessa direção científica é considerado o pesquisador americano Möller, que foi o primeiro a realizar contabilidade quantitativa mutações desse tipo em Drosophila e, assim, lançou as bases para a genética da radiação como uma nova direção científica.
Um número significativo de estudos sobre vários objetos levou ao desenvolvimento de ideias teóricas sobre o mecanismo do efeito biológico da lesão por radiação. Grauter introduziu o conceito de alvo - um volume celular "sensível", cuja derrota é responsável por alterar uma determinada reação na célula. A análise quantitativa dos efeitos mutagênicos sob a ação de várias doses de radiação permitiu revelar algumas regularidades.
No caso mais simples, quando um alvo é responsável pela reação observada na célula, e um golpe é necessário para destruí-la, o número de células afetadas cresce exponencialmente com o aumento da dose. A equação da curva de impacto único é descrita pela fórmula:
N / N o \u003d 1 - e D,
onde N o é o número total de células, N é o número de células inativadas (mortas), e é a base do logaritmo natural , a probabilidade de inativação em termos de 1 célula, D é a dose de radiação.
Com um mecanismo one-hit, o número de mutações é diretamente proporcional à dose:
Se forem necessários vários golpes para atingir o alvo, obtém-se uma curva em forma de S:
O estudo do impacto de diferentes tipos de radiação mostrou sua eficácia desigual. A presença de uma carga, massa e características energéticas de um elétron, próton, fóton e outras partículas determinam seus diferentes efeitos na célula, bem como a magnitude do efeito produzido na mesma dose de radiação. Descobriu-se também que, para diferentes organismos, tecidos e tipos diferentes mutações, a eficiência genética desses tipos de radiação pode ser diferente e diferir em dezenas ou até centenas de vezes.
A presença de oxigênio no ambiente no momento do aprendizado celular potencializa o efeito mutagênico, por isso foi introduzido o conceito do efeito oxigênio da radiação. Temperatura, irradiação infravermelha ou ultravioleta de um objeto pode ter um efeito semelhante. Nesse caso, os efeitos da exposição podem ser diferentes conforme o fator atue antes da irradiação, durante ela ou após a irradiação. A presença de água (que aparece em sementes de umidade diferente), a presença de reagentes químicos (formaldeído, metais pesados, etc.) também modifica drasticamente o efeito da exposição à radiação. Em humanos, esses fatores podem ser a presença no corpo de certos medicamentos ou substâncias protetoras (por exemplo, de natureza antioxidante).
Os fatores internos do corpo também se refletem na magnitude do efeito genético da radiação. Em primeiro lugar, isso se deve à fase do ciclo celular, quando a mesma dose de radiação tem efeito diferente mesmo em diferentes fases da meiose, o que foi demonstrado no estudo da gametogênese no trigo.
Ao caracterizar as fontes de radiação, o conceito de dose é usado. A dose de raios X e raios é medida em roentgens. Um roentgen é uma dose de radiação na qual em 1 cm 3 de ar em n.o. (0 o C e 1 atm.) 2 bilhões de pares de íons são formados. A formação de um par de íons requer uma energia de 34 eV.
A taxa de dose é medida em roentgens por unidade de tempo (min., hora), porque. está claro o que mais tempo quanto mais dura a radiação, maior o efeito que ela pode produzir.
A literatura também utiliza outros conceitos que refletem a presença de um objeto em condições de irradiação. Portanto, as unidades da dose de radiação absorvida por um objeto são medidas em Grays (Gy) para qualquer período de tempo:
1 raio-x \u003d 1 rad \u003d 0,01 Gray.
A taxa de dose absorvida por objetos é medida em sieverts (Sv), o que permite levar em consideração a localização de um objeto em territórios com Niveis diferentes radiação e por diferentes períodos de tempo por um determinado período:
1 r / s \u003d 1 REM (equivalente a roentgen) \u003d 0,01 Sv.
Os dados são resumidos e a dose total de radiação recebida pelo objeto durante qualquer período de tempo é determinada. Ao mesmo tempo, existem documentos regulamentares que determinam os valores limite de exposição para cada organismo. Portanto, para um soldado em situação de combate, uma dose de 50 r por mês é considerada relativamente inofensiva. Não importa se é recebido em 1 hora ou em pequenas doses em um mês.
A eficácia biológica da exposição à radiação pode até ser calculada teoricamente. Assim, para quebrar um fio cromossômico de 0,1 mícron de espessura, são necessárias 15-20 ionizações, o que equivale a uma dose de irradiação de 80-100 roentgens.
Para caracterizar o grau de contaminação do solo com substâncias radioativas, é utilizado o conceito de densidade de contaminação do solo, que é expresso em unidades - Curie (Cu, Ku) por 1 km 2 e corresponde a uma determinada taxa de dose de radiação:
1 Ku / km 2 \u003d 1 microdistrito / hora.
SOBRE EFICIÊNCIA BIOLÓGICA RELATIVA (RBE)
DIFERENTES TIPOS DE RADIAÇÃO
O RBE de um tipo de radiação para outro é definido como a razão das doses correspondentes que causam o mesmo efeito biológico. A eficiência da radiação depende em grande parte da taxa de perda linear de energia inerente a cada tipo de radiação.
A eficiência genética relativa depende em grande parte de uma variedade de condições no momento da irradiação ou mesmo depois dela, conforme discutido acima. Por exemplo, o RBE de nêutrons rápidos e raios-X por cromossomo em células de camundongos em uma atmosfera de oxigênio foi de 2,5 para 1, e quando irradiados em uma atmosfera de nitrogênio, foi de 6 para 1.
Em experimentos com células de fava, descobriu-se que o dano aos cromossomos por nêutrons e raios é de aproximadamente 10,5 para 1, e na ausência de oxigênio - 18 para 1. Em outra planta, tradescantia, foi demonstrado que o RBE de radiação pode chegar a 100 para 1.
Foi demonstrado em cultura de células humanas que, em todas as fases do ciclo celular, os raios X causam 1,5 vezes mais rearranjos cromossômicos do que os raios sozinhos.
O PROBLEMA DO LIMITE DO MÍNIMO
RADIAÇÃO E BAIXAS DOSES DE RADIAÇÃO
A dependência linear de mutações letais ligadas ao sexo em Drosophila revelada por Möller levou à questão do problema do limiar, ou seja, o nível mínimo de radiação que se acredita ser seguro para os organismos.
Spencer e Stern (1948) mostraram que o processo de mutação natural em Drosophila produz 1 mutação por 1.000 gametas. Uma dose de radiação de 50 roentgens dobra esse valor. A dependência linear dos resultados posteriores do experimento indicou a ausência de um limiar de dose mínima.
Presença de radiação de fundo natural e poluição meio Ambiente radionuclídeos devido ao aumento do conteúdo de prótons, por exemplo, o isótopo 40 K devido ao uso de fertilizantes ou acidentes como Chernobyl, ou por outros motivos, incl. o uso de substâncias radioativas na indústria ou em assuntos militares obrigam a um estudo mais aprofundado do problema das doses mínimas de radiação para os seres vivos, resultando em vários efeitos genéticos prejudiciais à vida dos organismos.
Estudos bioquímicos mostraram que na célula existem sistemas enzimáticos especiais para o reparo do material hereditário para casos de violações no material genético que ocorrem em uma determinada velocidade. Com o trabalho ativo constante de tal sistema, as mutações ocorrem a uma taxa de 10–8–10–9 nucleotídeos por divisão celular, que forma a base da mutagênese espontânea. Portanto, mesmo a dose mínima de irradiação do organismo apenas aumenta o número de distúrbios no material genético e, mesmo com a ativação do sistema de reparo de danos, o rendimento total da mutação será maior do que em condições normais.
Quando nos voltamos para o conceito de taxa de dose de radiação, ou seja, Se levarmos em conta o fator tempo, verifica-se que os efeitos genéticos aparecem em qualquer caso, e isso não depende da ação de doses baixas ou altas. Por um lado, isso se deve à ausência de um limiar inferior de radiação e, por outro lado, observa-se o princípio da acumulação (acumulação) de efeitos genéticos devido à ação de pequenas doses, uma vez que as mutações são alterações persistentes nos cromossomos. Portanto, o efeito da radiação pode aparecer fenotipicamente mais cedo quando uma determinada dose é tomada em um curto espaço de tempo, ou mais tarde se a dose absorvida for tomada por um longo período de tempo.
Assim, altas e baixas doses de radiação diferem neste aspecto apenas em termos de níveis de mutabilidade por unidade de exposição. No entanto, os efeitos genéticos da exposição a diferentes doses de radiação podem variar alguns por cento, várias vezes, ou mesmo dezenas e centenas de vezes, dependendo do tipo de tecido irradiado, da espécie do organismo e do seu estado fisiológico.
estudos citológicos O mecanismo dos rearranjos cromossômicos também permitiu provar que, com o aumento da dose de radiação, aumenta o número de violações na estrutura dos cromossomos (as chamadas aberrações, incluindo fragmentações e deleções).
O FENÔMENO DA MÁXIMA MUTAÇÃO
O estudo do problema do crescimento de mutações com o aumento da dose de irradiação do objeto levou à questão de saber se existe algum limite para o número máximo de mutações possíveis. Ao mesmo tempo, verificou-se também que quanto maior a energia das partículas e a perda de energia durante o movimento das partículas através do objeto, maior o valor da eficiência biológica relativa da radiação. Porém, como se viu, chega um momento em que a energia das partículas é tão alta que parte de sua energia não é mais utilizada e o RBE da radiação começa a diminuir. Em geral, a dependência do número de mutações na quantidade de irradiação tem um caráter complexo: a princípio cresce, atinge um platô e, em altas doses, o número de mutações (por células sobreviventes) diminui.
Este fenômeno foi chamado de fenômeno de doses máximas.
Aqui, alguns esclarecimentos devem ser feitos, pois nos experimentos houve sobreposição entre o fato do acúmulo de mutações e o número de células que morreram após a irradiação. A explicação se resume ao fato de que a princípio há um acúmulo de mutações, após o que, com um novo aumento da dose, as células mais radiossensíveis morrem, enquanto as radiorresistentes continuam exercendo suas funções. No final, restam muito poucos deles, ou seja, o tamanho do alvo para exposição à radiação é significativamente reduzido, o que leva a uma diminuição do efeito observado.
Estudos citológicos e bioquímicos mostraram que, com baixas doses de radiação, ocorrem principalmente mutações pontuais (alterações em nucleotídeos individuais), e o número de deleções intragênicas (perda de pequenas seções de DNA) é proporcional ao quadrado da dose.
EFEITO MUTAGÊNICO DO ULTRAVIOLETA
O problema do efeito mutagênico dos raios ultravioleta tem atraído a atenção do público em geral em relação aos estudos da camada de ozônio da Terra. A descoberta de "buracos" de ozono, a sua variabilidade de tamanho e localização acima do nosso planeta, por um lado, bem como a expansão das oportunidades de lazer nas montanhas e em costa marítima, por outro lado, aumentou significativamente a relevância de estudar o efeito da radiação ultravioleta na atividade vital dos organismos.
Os pesquisadores dividem o espectro ultravioleta em três áreas: UV-C - ultravioleta duro com comprimento de onda inferior a 280 nm, UV-B - médio com comprimento de onda na faixa de 280-320 nm e UV-A com comprimento de onda de 320-340 nm. O espectro do ultravioleta "duro" é absorvido pela atmosfera da Terra e não atinge sua superfície. O ultravioleta "médio" pode penetrar não apenas pelos "buracos" do ozônio, mas também quando a camada de ozônio está se afinando, o que é causado tanto por causas naturais quanto, aparentemente, pela atividade antropogênica. UV-A, como os cientistas acreditam, não efeitos nocivos sobre organismos.
Os microrganismos são os mais suscetíveis aos efeitos mutagênicos (e geralmente nocivos) dos UV-B, pois esses raios atingem facilmente seus núcleos com material hereditário. Também foi demonstrado que o ultravioleta tem um efeito mutagênico em todos os outros organismos se atingir o tecido generativo ou células germinativas (por exemplo, em plantas). Ao mesmo tempo, é mostrado o aparecimento de mutações somáticas que não são de natureza hereditária, mas causam alterações no funcionamento de células e tecidos, o que afeta a atividade vital dos organismos.
Foi demonstrado que a luz ultravioleta é capaz de induzir todos os tipos de mutações, cuja frequência depende da dose de radiação e da taxa de dose. O ultravioleta com comprimento de onda de 250-280 nm tem a maior eficiência, o que é explicado pela capacidade máxima do DNA de absorver luz com comprimento de onda na região de 260 nm (devido à estrutura das bases nitrogenadas). É por isso que esse ultravioleta destrói efetivamente as moléculas de DNA, o que explica a alta sensibilidade dos núcleos celulares.
O mecanismo de ação está associado à formação de dímeros, principalmente timina, além de citosina, uridina e até entre T e C. Tudo isso leva a distúrbios nas funções do DNA, relacionadas não apenas à transcrição, mas também ao processo de replicação .
Outro mecanismo de ação do ultravioleta é que, ao ser exposto ao meio aquático da célula, forma-se peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) e peróxidos orgânicos, que também têm efeito mutagênico no material hereditário da célula. Por exemplo, experimentos com E. coli mostraram que, quando cultivada em um meio pré-irradiado com luz ultravioleta, a frequência de mutações nas células aumenta de 50 a 100 vezes. Uma diminuição no teor de oxigênio ao cultivar Escherichia coli em um meio pré-irradiado ou uma diminuição na concentração de oxigênio durante a irradiação do meio reduz significativamente a formação de peróxidos e a frequência de mutações no microrganismo.
O espectro visível da luz (fotorreativação) tem efeito protetor contra a exposição à radiação ultravioleta, e sua capacidade de suprimir o efeito mutagênico da radiação ultravioleta foi comprovada experimentalmente. A luz visível também é capaz de suprimir parcialmente a ação da radiação ionizante, pois estimula a atividade de enzimas que reduzem a concentração de vários peróxidos. Essas enzimas incluem, por exemplo, catalases e citocromo oxidases.
A eficiência da fotorreativação também depende de outros fatores: o pH do meio, a temperatura, o estado fisiológico da célula e as características do genótipo.
MUTAGÊNESE QUÍMICA
O efeito mutagênico de compostos químicos foi descoberto em meados do século XX. Nas larvas de uma linha da mosca Drosophila, foi demonstrado que o formaldeído induziu o aparecimento de mutações letais em cerca de 6% dos casos. Além disso, foi revelado o efeito mutagênico do gás mostarda, uma substância venenosa usada durante a Primeira Guerra Mundial. Ao mesmo tempo, mostrou-se que substancias químicas pode causar não apenas todos os tipos de mutações pontuais, mas também rearranjos cromossômicos.
Até o momento, algumas substâncias são conhecidas por terem essa propriedade. Ao mesmo tempo, o uso de uma determinada substância é determinado principalmente pelo objetivo do experimento. Neste caso, a mutagenicidade de um composto químico é determinada, em primeiro lugar, pela possibilidade de sua penetração na célula mantendo sua viabilidade e, em segundo lugar, pela capacidade de atingir o núcleo celular, influenciar a estrutura e/ou funções dos cromossomos , e outros processos químicos na célula .
Você também deve levar em consideração a dosagem, o estado de agregação da substância, as características do objeto de estudo, o estágio de desenvolvimento do organismo e, para as células germinativas - o estágio da gametogênese. Às vezes, o efeito mutagênico de uma substância pode se manifestar apenas com um determinado método de introdução no corpo. Assim, se o formaldeído fosse usado como aditivo alimentar para larvas de moscas Drosophila, foi constatado seu efeito mutagênico. Em experimentos com o efeito de vapores dessa substância em larvas ou adultos, o efeito mutagênico do formaldeído não se manifestou.
Um grande número de mutagênicos químicos dá origem a tentativas de classificá-los, seja pela estrutura química, seja pelo efeito de ação.
Assim, N.P. Dubinin distingue 9 classes principais de mutagênicos químicos, entre os quais ele observa:
compostos alquilantes;
peróxidos;
aldeídos;
sais de metais pesados;
análogos de bases de DNA;
corantes
De acordo com a ação química, distinguem-se os seguintes grupos de substâncias:
radiomiméticos, uma vez que sua ação mutagênica é semelhante à da radiação ionizante (por exemplo, formaldeído, etil metanossulfonato, etc.);
peróxidos, cujos componentes ativos são -OH, -H, HO 2 - radicais, formados a partir de peróxidos sob a influência de fatores como oxigênio, água, ultravioleta, luz visível;
análogos de metabólitos, cujo mecanismo de ação é competir com os metabólitos convencionais e substituí-los. Estes são, por exemplo, derivados de bases de purina e pirimidina - bromuracil, aminopurina, bem como derivados de vitaminas, por exemplo, ácido fólico, etc.;
substâncias insuficientemente estudadas, cujo mecanismo de ação não é totalmente claro.
Em conclusão, também deve ser enfatizado que a radiação ionizante, ultravioleta e mutagênicos químicos causam a formação de mutações que se manifestam mais plenamente no zigoto de segunda geração se ocorrerem em células generativas. Este fenômeno é chamado de fenômeno de mutações atrasadas.
AÇÃO COMPLEXA DE FATORES EXTERNOS
Estudo de Impacto fatores individuais ambiente externo na variabilidade hereditária revela apenas alguns aspectos de sua influência no processo de mutação. Uma imagem muito mais complexa para interpretação é apresentada pelos resultados dos efeitos combinados de vários fatores ao mesmo tempo, o que geralmente ocorre na natureza. Portanto, para avaliar a contribuição de cada um dos fatores, experimentos especiais são montados de tal forma que em uma série de experimentos apenas um dos fatores varia dentro de limites relativamente amplos, enquanto os outros permanecem aproximadamente no mesmo nível. Os resultados obtidos são processados por métodos estatísticos especiais que permitem avaliar a contribuição de cada um dos fatores individualmente para o processo de mutação.
Por exemplo, em experimentos com Arabidopsis, foi estudada a interação da luz ultravioleta e visível no processo de mutação em várias formas genéticas dessa planta. Como característica estimada, foi utilizado um indicador - a sobrevivência das plantas. Nos experimentos, variaram a potência e a duração da radiação ultravioleta, bem como as propriedades restauradoras da luz visível. Verificou-se que a resistência das plantas aos efeitos nocivos da radiação ultravioleta é determinada em 22% pelas características do genótipo e em 18% pela intensidade da luz visível (PAR - radiação fotossinteticamente ativa).
Tais experimentos são de particular importância para prever as consequências causadas pelo impacto dos fatores nas biocenoses, para as quais modelos teóricos podem ser construídos com base nos resultados obtidos. Isso possibilita não apenas prever eventos negativos na cenose, mas, o mais importante, nos permitirá formular maneiras reais de evitá-los, a fim de preservar a biosfera da Terra como um todo ou seus componentes individuais.
USO DE MUTAGÊNESE PARA SELEÇÃO
A descoberta da mutagênese artificial (induzida) encontrou aplicação prática na reprodução um pouco mais tarde (desde a década de 1950), quando alguns mecanismos desse processo se tornaram claros e métodos para selecionar mutantes foram desenvolvidos. A obtenção de radiação e mutantes químicos de plantas agrícolas possibilitou a obtenção de variedades valiosas com toda uma gama de propriedades positivas: resistência ao acamamento, doenças, baixas temperaturas, aumento da produtividade econômica, etc.
A mutagénese induzida adquiriu particular importância na selecção de microrganismos. Na verdade, toda a indústria microbiológica para a produção de antibióticos, aminoácidos, vitaminas, etc. construído sobre o uso de mutantes de radiação, química e "ultravioleta".
Mutantes importantes foram obtidos do bicho-da-seda, que produz a seda natural.
1. Papel mutagênico de produtos químicos
2. Efeito da radiação
3. Lei das séries homólogas
1. Centenas de mutagênicos químicos foram descobertos. Alguns deles aumentam o efeito mutagênico muitas vezes em comparação com os espontâneos e são chamados supermutagens. Em experimentos, as mutações são induzidas por vários agentes químicos. Aparentemente, em vivo tais fatores causam o aparecimento de mutações espontâneas em vários organismos, inclusive humanos. O papel mutagênico de vários produtos químicos e mesmo alguns medicamentos, o que indica a necessidade de estudar a ação mutagênica de novas substâncias farmacológicas e outros compostos químicos amplamente utilizados na medicina e na agricultura. Mutágenos químicos possuir três qualidades:
Alto poder de penetração;
A propriedade de alterar o estado coloidal dos cromossomos;
Um certo efeito no estado de um gene ou cromossomo.
2. Induzido mutações causadas por irradiação (radiação),
foram descobertos pela primeira vez por cientistas soviéticos GA Nadson. Para chamar mutações artificiais usado frequentemente raios gama, cuja fonte pode ser, por exemplo, cobalto radioativo. A irradiação induz mutações gênicas e rearranjos cromossômicos estruturais de todos os tipos descritos acima - faltas, inversões, duplicações, etc. Todas as mudanças estruturais estão associadas à quebra cromossômica. A razão para isso são algumas características dos processos que ocorrem nos tecidos sob a ação da radiação. Radiação forte causar ionização nos tecidos que resultou:
Alguns átomos perdem elétrons;
Outros se juntam a eles;
Íons carregados positiva ou negativamente são formados. Um processo semelhante de rearranjo intramolecular, se ocorrer nos cromossomos, pode levar à sua fragmentação. provou que a relação entre exposição e alterações mutacionais também pode ser indireta. Aparentemente, a energia da radiação pode causar mudanças químicas no ambiente ao redor do cromossomo, o que leva à indução de mutações gênicas e rearranjos estruturais nos cromossomos. Um dos mais consequências perigosas irradiação - a formação de radicais livres OH ou HO2 durante a radiólise da água nos tecidos. Esses radicais são altamente reativos e podem atacar muitas substâncias orgânicas, incluindo os ácidos nucléicos.
3. Variedade mutações obedece a certos padrões que foram descobertos pela primeira vez em 1920 N.I. Vavilov. No comparação de características de diferentes variedades plantas cultivadas e espécies selvagens relacionadas muitas mudanças hereditárias comuns foram descobertas, o que permitiu a Vavilov formular a lei série homóloga na variabilidade hereditária: "Espécies e gêneros geneticamente próximos são caracterizados por séries semelhantes de variabilidade hereditária com tal regularidade que, conhecendo a série de formas dentro de uma espécie, pode-se prever a existência de formas paralelas em outras espécies e gêneros." Vavilov apontou que as séries homólogas geralmente vão além dos gêneros e até das famílias.
A lei da série homóloga na variabilidade hereditária está diretamente relacionada ao estudo de doenças hereditárias em humanos. As questões de tratamento e prevenção de doenças hereditárias não podem ser resolvidas sem estudos em larga escala em animais com anomalias hereditárias.
De acordo com a lei de Vavilov, mutações semelhantes às doenças hereditárias humanas devem ocorrer em animais. Assim, em cães, a hemofilia está ligada ao sexo. O albinismo foi documentado em muitas espécies de roedores, gatos, cães e pássaros. Modelos para o estudo da distrofia muscular camundongos e gado podem servir, epilepsia - coelhos e ratos, anomalias na estrutura dos olhos - muitas espécies de roedores, cães e porcos. A surdez hereditária é encontrada em porquinhos da índia, ratos e cachorros. Anomalias semelhantes ao lábio leporino e fenda palatina ocorrem em camundongos, cães e porcos.
A ação dos mutagênicos nas estruturas hereditárias do núcleo celular não é a mesma, portanto, ocorrem várias mutações. três tipos causada por uma mudança no número de cromossomos, uma mudança na estrutura dos cromossomos e uma mudança na estrutura de um gene (Apêndice 1).
As mutações também são divididas em Morfológicas, Fisiológicas e Bioquímicas.. Eles podem mudar a manifestação de qualquer sinal externo, influenciam as funções de órgãos individuais, o crescimento e desenvolvimento do corpo, causam várias mudanças composição química células e tecidos.
De acordo com a manifestação de mutações são dominante e recessivo, enquanto as mutações recessivas ocorrem com muito mais frequência do que as dominantes. O processo de mutação, via de regra, vai da dominância à recessividade. Mutações dominantes aparecem imediatamente no estado heterozigoto, recessivas - somente quando o gene mutado está no estado homozigoto.
De acordo com o efeito relativo na viabilidade e fertilidade do organismo, as mutações são divididas em útil, neutro e prejudicial. Útil as mutações aumentam a resistência do corpo a fatores ambientais adversos (temperaturas altas ou baixas, patógenos, etc.). Prejudicial as mutações retardam o crescimento, o desenvolvimento, causam a morte do organismo. Letal mutações acontecem dominante, que aparecem na primeira geração e são rapidamente retirados da população seleção natural, e recessivo, que se acumulam no genótipo e se manifestam em gerações subseqüentes.
A totalidade de todas as mutações que ocorrem em um organismo sob a influência de um fator mutagênico é chamada espectro de mutação. Uma grande variedade de mutações indica um amplo espectro de mutagênese, enquanto mutações do mesmo tipo indicam um espectro estreito.
A variabilidade mutacional ocorre em diferentes estágios de desenvolvimento de um organismo e em todas as suas células. As mutações que ocorrem em células germinativas em gametas e células a partir das quais os organismos são formados são chamadas generativo. As mutações que ocorrem nas células somáticas de um organismo são chamadas de somático. Por sua natureza, as mutações generativas e somáticas não são diferentes, pois sua ocorrência está associada a uma alteração na estrutura dos cromossomos e são formadas aproximadamente com a mesma frequência. No entanto, em termos de natureza de manifestação e significado para evolução e seleção, as diferenças entre esses tipos de mutações são muito significativas. Mutações generativas durante a reprodução sexual são transmitidas para a próxima geração de organismos. Ao mesmo tempo, as mutações dominantes aparecem já na primeira geração, enquanto as mutações recessivas aparecem apenas na segunda e nas gerações subsequentes, quando passam para o estado homozigoto. Mutações somáticas ocorrem em células diplóides, portanto aparecem apenas em genes dominantes ou em genes recessivos no estado homozigoto. Eles têm grande importância para a evolução de organismos com reprodução vegetativa.
Todas as mutações de acordo com o grau de sua manifestação fenotípica dividido por duas aulas: ampla(ou visível) e pequena. Grandes mutações são facilmente detectadas pelo aparecimento de várias anomalias morfológicas hereditárias. Pequenas mutações se manifestam através de pequenas alterações em características fisiológicas, morfológicas e quaisquer características quantitativas. As mutações principais são isoladas selecionando plantas alteradas individuais na segunda geração mutante (M 2 ). Pequenas mutações são detectadas como resultado do processamento matemático de dados sobre a variabilidade da característica estudada por famílias de plantas na terceira geração mutante (M 3). Pequenas mutações criam uma enorme variabilidade hereditária vários sinais nas populações de plantas, o que é de grande importância na seleção e evolução das espécies. Grandes mutações, com raras exceções, não dão origem a novas variedades e espécies, pois devido à baixa adaptação ao condições externas removidos pela seleção natural.
As mutações devem ser diferenciadas das morfoses ou manifestação fenotípica de traços, que são uma das formas de variabilidade individual não hereditária do organismo, portanto, não aparecem nas gerações subseqüentes.
Para obter mutações economicamente valiosas, 2.000 a 4.000 sementes são irradiadas. A seleção de mutações é mais frequentemente realizada em M 2. Devido ao fato de que nem todas as mutações são detectadas em M 2, a seleção também é realizada em M 3 . Às vezes, a seleção de mutações começa a ser realizada em M 1, enquanto as mutações dominantes são selecionadas para a característica de interesse (por exemplo, plantas altamente produtivas) para a seleção posterior de todas as mutações benéficas. Para acelerar e facilitar o isolamento de mutações benéficas, todas as plantas isoladas em M 1 são semeadas como progênie individual de plantas individuais (famílias) para obter a segunda geração mutante. Em M 2 selecione mutantes com características economicamente valiosas bem definidas e plantas para obter pequenas mutações em M 3 . No futuro, novas populações melhoradas são formadas a partir de mutantes valiosos, são usadas na reprodução (ao cruzar entre si ou com outras variedades). A eficiência da seleção aumenta com o teste ecológico obrigatório de mutantes.
O melhoramento por radiação, como método para obter novas variedades valiosas de plantas agrícolas e cepas altamente produtivas de microorganismos, é amplamente utilizado na prática. A seleção de radiação na produção agrícola inclui dois estágios:
1) o uso de radiação ionizante para obter formas mutantes valiosas de reprodução de plantas, que são usadas posteriormente no processo de reprodução como material de partida;
2) a inclusão de formas mutantes de plantas no trabalho de melhoramento para criar novas variedades com características valiosas de formas mutantes.
Para obter mutantes na produção agrícola, são utilizados raios X e radiação gama, radiação de nêutrons (nêutrons rápidos - 0,2-26 MeV e nêutrons lentos - 0,025 MeV) e isótopos radioativos (fósforo-32 e enxofre-35), etc. probabilidade de mutações durante a irradiação de vários objetos biológicos aumenta com o aumento da dose absorvida. No entanto, com o aumento da dose, a morte de indivíduos na população irradiada também aumenta, enquanto muitas mutações que surgiram não são detectadas. No melhoramento de plantas por radiação, muitas vezes são usadas doses nas quais 70% das plantas morrem. Essas doses são chamadas crítico. Em 30% das plantas sobreviventes, pode-se observar um grande número de mutações de vários tipos. Na maioria das vezes, mutantes economicamente valiosos são formados em doses mais baixas de radiação, nas quais apenas 20-30% das plantas morrem. O valor da dose de radiação depende da radiossensibilidade dos objetos biológicos. Por exemplo, as doses de irradiação de sementes com raios X e radiação gama para a liberação de mutações benéficas em trigo, cevada e milho são 50-100 Gy, em aveia - 70-100 Gy, em tremoço - 140-160 Gy.
Sob a influência da radiação ionizante, mutações genéticas (ou pontuais) e mutações cromossômicas (ou genômicas). mutações genômicas, acompanhado por uma diminuição no número de cromossomos (aneuploidia) e um aumento no número de cromossomos (poliploidia) em 2 ou 4 vezes são raramente observados. As formas aneuploides de plantas têm defeitos morfológicos agudos e não são de interesse para reprodução por radiação. Formas poliploides de plantas são mutações letais, então eles morrem. Para o trabalho de reprodução, formas poliploides viáveis de plantas são obtidas usando o método de mutagênese química, enquanto a colchicina é frequentemente usada como uma droga mutagênica. Para a seleção de radiação, as mutações genéticas são de maior interesse. Deve-se lembrar que geneé uma seção específica da molécula de DNA. Mutações gênicas são induzidas nas bases purínicas e pirimídicas da molécula de DNA durante sua radiólise, o que leva a uma alteração Código genético e, por fim, ao surgimento de novos signos formados sob a ação da irradiação. Na formação de mutações, também desempenham um papel importante os processos de reparação de rupturas únicas da molécula e os processos de reparação de danos de base.
O rendimento das mutações de radiação depende da dose de irradiação, taxa de dose de irradiação, tipo de radiação e transferência linear de energia (LET) e do estágio de ontogênese da planta. A frequência das mutações aumenta proporcionalmente à dose de radiação. No entanto, com o aumento da dose, a frequência de aberrações cromossômicas e morte celular aumenta, de modo que as mutações resultantes não são detectadas. O valor absoluto da dose depende da radiossensibilidade de um determinado organismo exposto. Freqüentemente, mutantes de plantas economicamente úteis são formados quando as sementes são irradiadas com uma dose que causa a morte de 20-30% das plantas.
O surgimento de mutações, como qualquer efeito radiobiológico, é um processo de vários estágios envolvendo, por um lado, substâncias que aumentam o rendimento das mutações e, por outro lado, enzimas reparadoras que reduzem o rendimento das mutações. Com uma alta taxa de dose de radiação, mais mutações são formadas, porque com uma baixa taxa de dose, os processos de reparo têm tempo para ocorrer já no processo de irradiação. Sob irradiação crônica de plantas em desenvolvimento (a uma taxa de dose baixa), as plantas são irradiadas em fases de desenvolvimento que são diferentes em radiossensibilidade, de modo que o espectro de mutações é mais diversificado, ou quando as plantas são irradiadas em um estágio específico de desenvolvimento alto poder doses. Com a diminuição da taxa de dosagem, o número de distúrbios cromossômicos diminui, portanto, a morte de células e plantas diminui.
Foi estabelecido que, quando irradiado com radiação com baixo LET (raios X e radiação gama), a maioria dos danos cromossômicos é restaurada. Entre as plantas mutantes, são identificadas formas com sinais de resistência a doenças e aumento do teor de substâncias valiosas. A radiação com alto LET (nêutrons) causa danos mais profundos nos cromossomos que não são restaurados, portanto, nas plantas mutantes sobreviventes, várias violações de caracteres morfológicos são reveladas.
O rendimento e a qualidade das mutações dependem não apenas propriedades físicas radiação, mas também sobre o estado do genoma tanto no momento da irradiação quanto no período pós-radiação da formação final da mutação. No melhoramento de plantas por radiação, as sementes dormentes de plantas secas ao ar são frequentemente irradiadas. A irradiação de sementes em diferentes períodos de formação, desde o momento da formação de um óvulo fertilizado até o estado de dormência profunda, dá resultados não idênticos. A frequência e a eficiência das mutações aumentam significativamente quando as plantas são irradiadas durante o período de fusão dos gametas e formação do zigoto, na fase de conclusão da formação do embrião e na fase de intensificação dos processos de crescimento do embrião durante a germinação das sementes .
Para obter plantas mutantes, é utilizado o método de irradiação do pólen durante sua maturação, seguido de polinização artificial de plantas não irradiadas com pólen irradiado.
Mutantes de plantas economicamente úteis que combinam alta produtividade com outras características aparecem, via de regra, muito raramente. Formas mutantes valiosas de seleção de plantas são distinguidas pelo conteúdo nutrientes, maturidade precoce, resistência a doenças, resistência ao acamamento, aumento da produtividade e outras características. Formas mutantes são usadas como doadoras de uma característica útil no melhoramento de plantas. Com base na mutagênese por radiação na produção agrícola, as questões de obtenção de novas variedades de plantas agrícolas caracterizadas por altos rendimentos, resistência a condições adversas ambiente e pragas patogênicas. Os criadores, usando o efeito mutagênico da irradiação gama, reduzem o tempo de criação de novas variedades de grãos em quase 5 vezes.
Até agora, mais de 1000 variedades foram registradas. várias plantas criado a partir de formas mutantes de plantas obtidas por radiação ionizante. A maioria dessas variedades foi obtida de cevada (72 variedades), arroz (65 variedades), trigo (38 variedades), feijão (10 variedades), amendoim (15 variedades), que combinam alto rendimento e melhor qualidade do grão com alta plasticidade ambiental. Em plantas ornamentais, foram obtidos mais de 500 mutantes de radiação, que se distinguem por excelentes formas decorativas, resistência a doenças e boa capacidade adaptativa a fatores ambientais adversos.
NO microbiológico Na prática, as doses são geralmente usadas nas quais 1-5% dos microorganismos sobreviventes permanecem. O método de radiação foi usado para obter uma cepa de microorganismo para a produção de leite em pó nislactina, que, quando adicionada aos queijos processados, melhora a qualidade e prolonga a vida útil. A nislactina é usada em aditivos alimentares ao alimentar leitões, aumentando o ganho de peso dos leitões e melhorando sua estado geral. Pelo método de seleção por radiação, foram obtidas novas formas de microorganismos, que são os agentes causadores de doenças em várias pragas de culturas agrícolas. Por exemplo, recebeu agente causador da muscardinose para mais de 60 tipos de insetos-praga (traça-da-maçã, bicho-do-pão, gorgulho-do-feijão, etc.). De particular interesse e valor prático em mutações de radiação de microorganismos são as mutações genéticas que afetam indiretamente a atividade das enzimas. Ao mesmo tempo, a enzima é ativada, e as reações catalisadas por esta enzima são mais intensas que o normal, portanto, a produção de um ou outro metabólito - antibióticos, aminoácidos, etc. - aumenta nos microorganismos.
A irradiação de culturas de levedura resultou em raças que produzem duas vezes mais ergosterol, o que é de grande importância para a indústria de vitaminas.
A exposição combinada à radiação e agentes mutagênicos químicos produziu muitas cepas de altamente ativo fungos de mofo que produzem penicilina, estreptomicina, aureomicina, eritromicina e albumicina. Algumas cepas de fungos mofo produzem 20 vezes mais estreptomicina e 50 vezes mais penicilina do que as raças originais. A produção industrial de antibióticos expandiu muito sua disponibilidade para o público.
Índice da disciplina "Elementos Genéticos de Bactérias. Mutações em Bactérias. Transdução.":Mutagênese química. Algum químico substâncias ( mutagênicos) aumentam significativamente a taxa de mutação para uma célula mutante por 103-104 células. Essas substâncias incluem análogos de bases nitrogenadas (por exemplo, bromuracil), que estão incluídos na molécula de DNA e causam a inserção de uma base incorreta durante a replicação (em particular, o bromuracil é semelhante em estrutura à timina, está incluído no DNA como um parceiro da adenina, e então passa para a forma enol e é reconhecido pela polimerase como citosina, o que leva à incorporação de guanina em vez de adenina); agentes alquilantes (por exemplo, metanossulfonato de etil alquilam predominantemente o átomo de nitrogênio guanina); ácido nitroso, bases nitrogenadas desaminantes; agentes intercalantes (por exemplo, corantes de acridina) que penetram entre as bases do DNA e causam um aumento da distância entre elas, o que leva à perda de nucleotídeos, inclusão de um par adicional de nucleotídeos, etc.
Mutagênese de radiação geralmente leva à formação de dímeros de pirimidina. UV, raios-X e outros tipos de radiação ionizante têm efeitos letais (suprimindo a atividade vital) e mutagênicos nos microorganismos.
Mutações pode induzir os seguintes eventos: modificações de bases (alterações em nucleotídeos individuais), inserções (inclusão de bases adicionais), divisão (perda de uma base ou grupo de bases) e deformação da hélice do DNA.
Modificação de base envolve uma mudança química na base nitrogenada na sequência de codificação, resultando em uma mudança de códon. Como resultado, em vez de um aminoácido, outro é codificado ou um códon sem sentido aparece.
Inserção ou exclusão quaisquer bases (análogos de bases) no DNA levam a mutações de frameshift(mutações frameshift), que causam uma mudança na posição do frame de um códon tripleto e, portanto, uma mudança em todos os códons subseqüentes.
deformações da hélice do DNA(distorções estruturais do DNA) são formadas como resultado da dimerização induzida por UV de nucleotídeos próximos (especialmente timina). O anel de ciclobutano resultante quebra a simetria do DNA e impede a replicação adequada. A replicação também pode ser interrompida pela formação de ligações transversais de DNA entre cadeias. Dependendo da síntese de polipeptídeos “corretos” ou “incorretos” durante a leitura do mRNA que refletiu alterações no DNA (ou seja, dependendo da preservação da função semântica do polipeptídeo resultante), existem vários tipos de mutações.
mutações "silenciosas"(mutações "sem alterar o significado", ou seja, não causando alterações na sequência de aminoácidos da proteína). Seu aparecimento é possível devido à degeneração do código genético. O trigêmeo resultante da mutação codifica o mesmo aminoácido do trigêmeo original, de modo que a proteína sintetizada permanece inalterada.
Mutações sem sentido(mutações "com mudança de significado") ocorrem sob a condição de que mudanças na sequência de codificação levem ao aparecimento de um aminoácido diferente no polipeptídeo. A proteína alterada resultante pode ser funcional ou não funcional, dependendo da importância da área afetada pela mutação.
Mutações Sem Sentido(mutações "antisense", "sem sentido") levam à formação de um dos três códons terminadores (UAG, UAA, UGA), causando o término prematuro da síntese da cadeia polipeptídica. Quando o ribossomo atinge tal códon, o processo de alongamento da cadeia polipeptídica termina e um peptídeo incompleto é liberado (provavelmente, tal ação dos códons terminais se deve à ausência de tRNAs que se ligam a esses códons). este mutação leva à síntese de proteínas não funcionais muito curtas ou à cessação completa da síntese de proteínas.
