Лекция 12
СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ
Различают два вида мутагенеза в зависимости от природы этого явления. Один определяется сложностью биохимических и молекулярно-биологических процессов в клетке, другой – внешними факторами среды, в которой организм развивается и осуществляет жизненные функции.
ПРЕДМУТАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Закономерности изменчивости изучены всё ещё недостаточно. Часто мы не знаем, когда и в каком гене произойдёт мутация, какой признак будет изменён, будет ли мутация вредной или полезной для организма.
С другой стороны, вспомним из курса биохимии, что в клетках существует специальная ферментная система репарации, которая исправляет ошибки репликации и таким образом снижает частоту ошибок до 10 –8 – 10 –10 . Однако, принимая во внимание особенности организмов, можно говорить о том, что чем больше геном, тем потенциально большее число спонтанных или индуцированных мутаций может образовываться в нём. При этом показано, что мутагенез происходит даже в сухих семенах и покоящихся клетках, что может быть связано с тем, что ДНК таких биосистем находится в А-форме.
Говоря о предмутационных изменениях, следует помнить о том, что они фактически представляют собой мутации, существующие ограниченное время, за которое ферменты репарации успевают их исправить. И только небольшая часть таких изменений переходит в истинные мутации. Действие дополнительного фактора (даже не мутагенного, напр., температуры) может приводить к увеличению числа наблюдаемых мутаций, поскольку этот фактор нарушает работу ферментов репарации. Такое явление показано, напр., для мушки дрозофилы, у которой число мутаций значительно возрастало, если после облучения рентгеновскими лучами их дополнительно подвергали воздействию повышенной температуры. Явление получило название ЭФФЕКТ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ. При этом не следует забывать о том, что мутации появляются в следующих поколениях.
В завершение необходимо отметить, что хотя изучение мутагенеза методами генной инженерии и является крупным шагом, оно вовсе не избавляет от необходимости исследовать закономерности мутационного процесса на уровне клетки или целого организма.
В предыдущей теме мы говорили о том, что в основе мутаций лежат изменения нуклеотидов, причём мутационный процесс в разных участках хромосом (ДНК) может идти с разной скоростью, которая во многом зависит от наличия там метилированных азотистых оснований. Рассматривая же мутационный процесс в отношении целых организмов, следует сказать о том, что у каждого вида животного, растения или бактерии частота возникновения мутаций и направления мутирования – разные. Эти различия обусловлены влиянием многих факторов: генотипическими особенностями вида, степенью его адаптации к условиям внешней среды, силой действия природных факторов и т.д.
Напр., при изучении мутационного процесса у дрозофилы было установлено, что в целом по организму при учёте видимых, а также разнообразных малых мутаций оказывается, что около 5% гамет в каждом поколении приобретает новые мутации. В отношении отдельных хромосом было выявлено, что в половой Х-хромосоме возникают мутации летального характера с частотой 0,15% за одно поколение, а возникновение мутаций во второй хромосоме происходит с частотой около 0,5%.
Также была выявлена различная мутабильность отдельных генов. Напр., у кукурузы этот показатель для гена красной окраски алейрона составляет 1,1 на 100 тысяч гамет, а для гена, обеспечивающего синтез пигмента антоциана – 182 на 100 тысяч гамет.
Замечено, что сходные гены в разных генотипах мутируют с разной скоростью.
Накопленный экспериментальный материал позволяет говорить о том, что спонтанное мутирование гена в определённой степени зависит от физиологических и биохимических изменений клетки, вызванных влиянием внешних факторов. При этом появление естественных (самопроизвольных) мутаций у микроорганизмов вовсе не требует контакта клетки с тем фактором, по отношению к которому могут появиться мутации, обеспечивающие их приспособительные реакции.
Широко представлены спонтанные мутации у человека. Так, на 1 млн образующихся гамет приходится около 400, несущих мутации по талассемии, 70 – по хондродистрофии, 28 – по альбинизму и цветовой слепоте, 32 – по гемофилии.
К факторам естественного мутационного процесса следует отнести не только ошибки в процессе репликации, транскрипции и трансляции, но и такие, которые могут быть вызваны изменениями физиолого-биохимических процессов в клетке (напр., повышенным образованием пероксида водорода или других веществ подобного действия). При этом ОСНОВУ появления естественных мутаций составляют, по-видимому, факторы внешней среды.
До недавнего времени главенствующую роль в этом процессе отводили естественному радиационному фону, складывающемуся из космических лучей, земной радиации и действия радиоактивных изотопов, попадающих в организм извне, в т.ч. с пищей (напр., Ra, 40 K и т.п.). Величина этого фона составляет 0,12-0,23 рада в год.
Влияние радиации на организмы с коротким жизненным циклом может быть небольшим. Но у человека в ходе онтогенеза до 25% от общего числа мутаций может возникать именно под влиянием естественного радиоактивного фона. Растения, живущие до тысячи лет и более (напр., секвойи), могут испытывать ещё большее влияние этого фактора.
Изучение описываемой проблемы привело к открытию специфических веществ – антимутагенов , обеспечивающих своеобразную защиту организмов от этого фактора, а также иных механизмов, связанных с регуляцией мутационного процесса в целом. Прежде всего, это – открытие генов-мутаторов, способствующих увеличению мутагенного процесса в определённых участках хромосом в 1-2 тысячи раз, что частично связано с изменением механизма действия одного из центральных ферментов репликации ДНК – ДНК-полимеразы. Также показано функционирование гена-антимутатора, который регулирует активность указанного фермента, и этим снижает число мутаций, возникающих при репликации. Аналогичные механизмы воздействия описанных генов показаны и для других белков и ферментов – участников процесса репликации ДНК: ДНК-лигазы, ДНК-связывающих белков и иных белков.
Было также выявлено, что образование мутаций можно генетически заблокировано так же, как и любой другой физиологический процесс. Напр, изменение генов lex A или rec A у бактерии E.coli ведёт к частичному или полному подавлению мутационного процесса под действием ионизирующих излучений, ультрафиолетового света или некоторых химических мутагенов.
ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ
Под индуцированным мутационным процессом понимают возникновение наследственных изменений под влиянием направленного воздействия факторов внешней или внутренней среды. Изменения являются следствием сложных физиологических процессов клетки, в основе которых лежат химические и физико-химические реакции.
Первые результаты в указанном направлении были получены ещё в начале ХХ века. При этом наибольшие успехи были достигнуты в изучении действия ионизирующих излучений, которые были главными объектами исследований физиков того времени.
Открытие Надсона и Филиппова в 1925 году мутагенного действия лучей радия при обработке ими клеток дрожжей начало эпоху индуцированного мутагенеза. Однако основателем этого научного направления считают американского исследователя Мёллера, который первым провёл количественный учёт мутаций этого типа у дрозофилы и таким образом положил начало радиационной генетике как новому научному направлению.
Значительное число исследований на различных объектах привели к развитию теоретических представлений о механизме биологического эффекта лучевого поражения. Граутер ввёл понятие мишени – «чувствительного» объема клетки, поражение которого ответственно за изменение определённой реакции в клетке. Количественный анализ мутагенных эффектов при действии различных доз радиации позволил выявить некоторые закономерности.
В простейшем случае, когда за наблюдаемую реакцию в клетке ответственна одна мишень, для поражения которой необходимо одно попадание, число поражённых клеток растёт экспоненциально с ростом дозы. Уравнение одноударной кривой описывается формулой:
N / N o = 1 – e D ,
где N o – общее число клеток, N – число инактивированных (погибших) клеток, е – основание натурального логарифма вероятность инактивации в пересчёте на 1 клетку, D – доза радиации.
При одноударном механизме количество мутаций прямо пропорционально дозе:
Если для поражения мишени нужно несколько попаданий, то получают S-образную кривую:
Изучение воздействия разных видов излучения показало их неодинаковую эффективность. Наличие заряда, массы и энергетических характеристик электрона, протона, фотона и других частиц определяют их различное воздействие на клетку, а также величину производимого эффекта при одинаковой дозе излучения. Оказалось также, что для разных организмов, тканей и разных типов мутаций генетическая эффективность указанных видов излучений может быть различной и отличается в десятки ил даже сотни раз.
Присутствие кислорода в среде в момент обучения клетки усиливает мутагенный эффект, поэтому введено понятие о кислородном эффекте излучений. Аналогичное влияние могут оказывать температура, инфракрасное или ультрафиолетовое облучение объекта. При этом эффекты воздействия могут быть разными в зависимости от того, действует ли фактор до облучения, во время оного, или после облучения. Также резко модифицирует эффект воздействия радиации присутствие воды (что показано на семенах различной влажности), присутствие химических реагентов (формальдегида, тяжёлых металлов и т.п.). У человека такими факторами могут быть – присутствие в организме определённых лекарств или защитных веществ (напр., антиокислительной природы).
Внутренние факторы организма также отражаются на величине генетического эффекта радиации. Прежде всего, это связано с фазой клеточного цикла, когда одна и та же доза радиации оказывает разное влияние даже в разные фазы мейоза, что было показано при изучении гаметогенеза у пшеницы.
Характеризуя источники излучения, используют понятие дозы. Дозу рентгеновских и лучей измеряют в рентгенах. Один рентген – это такая доза излучения, при которой в 1 см 3 воздуха при н.у. (0 о С и 1 атм.) образуется 2 млрд пар ионов. На образование одной пары ионов необходима энергия в 34 эВ.
Мощность дозы измеряют в рентгенах в единицу времени (мин., час), т.к. понятно, что чем большее время длится излучение, тем больший эффект оно может производить.
В литературе также используются другие понятия, отражающие нахождение объекта в условиях облучения. Поэтому единицы поглощённой дозы радиации объектом измеряют в Греях (Гр) за какой-либо отрезок времени:
1 рентген = 1 рад = 0,01 Грея.
Мощность поглощённой дозы объектами измеряют в зивертах (Зв), что даёт возможность учёта нахождения объекта на территориях с разным уровнем излучения и в течение разных отрезков времени за определённый период:
1 р/с = 1 БЭР (биологический эквивалент рентгена) = 0,01 Зв.
Данные суммируются, и определяется общая доза излучения, полученная объектом за какой-либо период времени. При этом существуют нормативные документы, которые определяют предельные величины облучения для каждого организма. Так для солдата в боевой обстановке относительно безвредной считает доза в 50 р за месяц. При этом не важно, получена ли она за 1 час или малыми дозами в течение месяца.
Биологическая эффективность воздействия радиации может быть даже теоретически просчитана. Так, чтобы разорвать нить хромосомы толщиной 0,1 мкм, необходимо 15-20 ионизаций, что в пересчёте эквивалентно дозе облучения в 80-100 рентген.
Для характеристики степени загрязнения почвы радиоактивными веществами используют понятие плотности загрязнения почвы, которую выражают в единицах – Кюри (Cu, Ku) на 1 км 2 и соответствует определённой мощности дозы излучения:
1 Ku / км 2 = 1 мкр/час.
ОБ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ (ОБЭ)
РАЗНЫХ ВИДОВ ИЗЛУЧЕНИЙ
ОБЭ одного вида излучений к другому определяют, как соотношение соответствующих доз, вызывающих одинаковый биологический эффект. Эффективность излучения во многом зависит от скорости линейной потери энергии, свойственной каждому виду излучения.
Относительная генетическая эффективность в значительной степени зависит от множества условий в момент облучения или даже после него, о чём говорилось выше. Напр., ОБЭ быстрых нейтронов и рентгеновских лучей на хромосомы в клетках мышей в атмосфере кислорода составляла 2,5 к 1, а при облучении в атмосфере азота – 6 к 1.
В экспериментах на клетках конских бобов установлено, что поражение хромосом нейтронами и -лучами составляет примерно 10,5 к 1, а в отсутствие кислорода – 18 к 1. На другом растении – традесканции показано, что ОБЭ излучений может достигать 100 к 1.
На культуре клеток человека показано, что на всех фазах клеточного цикла рентгеновские лучи вызывают в 1,5 раза больше хромосомных перестроек, чем только -лучи.
ПРОБЛЕМА ПОРОГА МИНИМАЛЬНОЙ
РАДИАЦИИ И МАЛЫХ ДОЗ ОБЛУЧЕНИЯ
Выявленная Мёллером линейная зависимость летальных, сцепленных с полом мутаций у дрозофилы привели к постановке вопроса о проблеме порога, т.е. того минимального уровня радиации, который, как полагали, является безопасным для организмов.
Спенсер и Штерн (1948) показали, что при естественном мутационном процессе у дрозофилы возникает 1 мутация на одну тысячу гамет. Доза радиации в 50 рентген удваивает эту величину. Прямолинейная зависимость дальнейших результатов эксперимента указывала на отсутствие минимального порога дозы.
Наличие естественного радиационного фона и загрязнение окружающей среды радионуклидами за счёт увеличения содержания протонов, напр., изотопа 40 К из-за использования удобрений или аварий вроде Чернобыльской, либо за счёт иных причин, в т.ч. использовании радиоактивных веществ в промышленности или в военном деле, заставляют более тщательно изучать проблему минимальных доз облучения живых существ, в результате чего возникают различные генетические эффекты, вредные для жизнедеятельности организмов.
Биохимические исследования показали, что в клетке существуют специальные ферментные системы репарации наследственного материала для случаев возникновения нарушений в генетическом материале, которые идут с определённой скоростью. При постоянной активной работе такой системы мутации возникают со скоростью 10 –8 – 10 –9 нуклеотидов на одно клеточное деление, что составляет основу спонтанного мутагенеза. Поэтому даже минимальная доза облучения организма только добавляет количество нарушений в генетический материал, и даже при активации системы репарации повреждений общий выход мутаций будет более высоким, чем при обычных условиях.
Когда мы переходим к понятию мощности дозы облучения, т.е. учитываем фактор времени, то оказывается, что генетические эффекты проявляются в любом случае, и это не зависит от действия малых или высоких доз. С одной стороны, это связано с отсутствием нижнего порога радиации, а, с другой, - наблюдается принцип кумуляции (накопления) генетических эффектов за счёт действия малых доз, поскольку мутации являются стойкими изменениями в хромосомах. Поэтому радиационный эффект фенотипически может проявиться раньше при наборе определённой дозы за короткое время, либо – позже, если поглощённая доза набирается за длительный период времени.
Таким образом, высокие и малые дозы облучения различаются в этом аспекте только по уровням мутабильности на единицу облучения. Однако, генетические эффекты воздействия различных доз облучения могут различаться на несколько процентов, в несколько раз или даже десятков и сотен раз в зависимости от типа облучаемой ткани, видовой принадлежности организма, его физиологического состояния.
Цитологические исследования механизма хромосомных перестроек также позволили доказать, что с ростом дозы облучения растёт число нарушений в структуре хромосом (так называемых аберраций, в т.ч. фрагментаций и делеций).
ФЕНОМЕН МАКСИМУМА МУТАЦИЙ
Изучение проблемы роста мутаций с увеличением дозы облучения объекта привело к возникновению вопроса о том, существует ли какой-либо предел максимального числа возможных мутаций. При этом также было установлено, что чем больше энергия частиц и потеря энергии при движении частиц сквозь объект, тем выше величина относительной биологической эффективности излучения. Однако, как оказалось, наступает такой момент, когда энергия частиц настолько велика, что часть их энергии уже не используется, и ОБЭ излучения начинает уменьшаться. В целом кривая зависимости числа мутаций от величины облучения имеет сложный характер: вначале она растёт, достигает плато, а при высоких дозах число мутаций (в расчёте на оставшиеся в живых клетки) снижается.
Это явление было названо феноменом максимальных доз.
Здесь следует привести некоторые уточнения, поскольку в экспериментах происходила накладка факта накопления мутаций и числа погибших после облучения клеток. Объяснение сводится к тому, что вначале происходит накопление мутаций, после чего с дальнейшим ростом дозы гибнут наиболее радиочувствительные клетки, а радиоустойчивые продолжают выполнять свои функции. В конечном итоге их остаётся очень мало, т.е. величина мишени для воздействия излучения значительно уменьшается, что и приводит к снижению наблюдаемого эффекта.
Цитологические и биохимические исследования показали, что при малых дозах облучения возникают, в основном, мутации точечного характера (изменения отдельных нуклеотидов), а число внутригенных делеций (выпадение небольших участков ДНК) пропорционально квадрату дозы.
МУТАГЕННЫЙ ЭФФЕКТ УЛЬТРАФИОЛЕТА
Проблема мутагенного влияния ультрафиолетовых лучей привлекла внимание широкой общественности в связи с исследованиями озонового слоя Земли. Обнаружение озоновых «дыр», их непостоянство в размерах и местоположениях над нашей планетой, с одной стороны, а также расширение возможностей для отдыха в горах и на морском побережье, с другой стороны, значительно повысили актуальность изучения влияния ультрафиолета на жизнедеятельность организмов.
Исследователи делят ультрафиолетовый спектр на три области: УФ-С – жёсткий ультрафиолет с длинами волн менее 280 нм, УФ-В – средний с длинами волн в диапазоне 280-320 нм и УФ-А с длиной волн 320-340 нм. Спектр «жёсткого» ультрафиолета поглощается атмосферой Земли и не достигает её поверхности. «Средний» ультрафиолет может проникать не только через озоновые «дыры», но и при истончении озонового слоя, что вызывается как естественными причинами, так и, по-видимому, антропогенной деятельностью. УФ-А, как полагают учёные, не оказывает вредного воздействия на организмы.
В наибольшей степени мутагенному (и обычно вредному) воздействию УФ-В подвержены микроорганизмы, поскольку эти лучи легко достигают у них ядер с наследственным материалом. Также показано, что мутагенное действие ультрафиолет оказывает и на все другие организмы, если он достигает генеративной ткани или половых клеток (напр., у растений). В то же время показано появление соматических мутаций, не носящих наследственного характера, но вызывающих изменения в функционировании клеток и тканей, что отражается на жизнедеятельности организмов.
Показано, что ультрафиолет способен вызывать все виды мутаций, частота которых зависит от дозы облучения и мощности дозы. Наибольшей эффективностью обладает ультрафиолет с длинами волн в 250-280 нм, что объясняется максимальной способностью ДНК поглощать свет с длиной волны в области 260 нм (благодаря структуре азотистых оснований). Именно поэтому такой ультрафиолет эффективно разрушает молекулы ДНК, что объясняет высокую чувствительность ядер клеток.
Механизм действия связан с образованием димеров, в основном, тимина, а также – цитозина, уридина и даже между Т и Ц. Всё это приводит к нарушениям функций ДНК, касающихся не только транскрипции, но и процесса репликации.
Иной механизм действия ультрафиолета состоит в том, что при его воздействии на водную среду клетки происходит образование пероксида водорода (Н 2 О 2) и органических пероксидов, также оказывающих мутагенный эффект на наследственный материал клетки. Напр., в экспериментах на E.сoli показано, что при её выращивании на среде, предварительно облучённой ультрафиолетом, частота мутаций в клетках возрастает в 50-100 раз. Снижение содержания кислорода при выращивании кишечной палочки на предварительно облучённой среде или снижение концентрации кислорода во время облучения среды значительно уменьшают образование пероксидов и частоту мутаций у микроорганизма.
Защитным действием против воздействия ультрафиолета обладает видимый спектр света (фотореактивация), и экспериментально доказана его способность подавлять мутагеннй эффект ультрафиолета. Видимый свет также способен частично подавлять действие ионизирующих излучений, поскольку он стимулирует активность ферментов, снижающих концентрацию различных пероксидов. К числу таких ферментов относятся, напр., каталазы и цитохромоксидазы.
Эффективность фотореактивации также зависит от иных факторов: рН среды, температуры, физиологического состояния клетки, а также особенностей генотипа.
ХИМИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ
Мутагенный эффект химических соединений был открыт в середине ХХ столетия. На личинках одной из линий мухи дрозофилы было показано, что формальдегид индуцировал появление летальных мутаций примерно в 6% случаев. Далее было выявлено мутагенное действие иприта – отравляющего вещества, использованного в период Первой мировой войны. При этом было показано, что химические вещества могут вызывать не только все виды точковых мутаций, но и хромосомные перестройки.
К настоящему времени известно довольно много веществ, обладающих таким свойством. В то же время использование конкретного вещества определяется в первую очередь целью эксперимента. При этом мутагенность химического соединения определяется, во-1-х, возможностью его проникновения в клетку при сохранении её жизнеспособности и, во-2-х, способностью достигать ядра клетки, влиять на структуру и/или функции хромосом, и иные химические процессы в клетке.
Также следует учитывать дозировку, агрегатное состояние вещества, особенности объекта исследования, стадию развития организма, а для половых клеток – стадию гаметогенеза. Иногда мутагенное действие вещества может проявиться только при определённом методе его введения в организм. Так, если формальдегид использовали в качестве пищевой добавки для личинок мухи дрозофилы, то обнаруживали его мутагенное действие. В экспериментах с воздействием паров этого вещества на личинки или взрослые особи мутагенное действие формальдегида не проявлялось.
Большое число химических мутагенов даёт основание для попыток их классификации либо по химической структуре, либо по эффекту действия.
Так, Н.П.Дубинин выделяет 9 основных классов химических мутагенов, среди которых отмечает:
алкилирующие соединения;
пероксиды;
альдегиды;
соли тяжёлых металлов;
аналоги оснований ДНК;
красители
По химическому действию выделяют следующие группы веществ:
радиомиметические, поскольку их мутагенное действие подобно действию ионизирующих излучений (напр., формальдегид, этилметансульфонат и др.);
пероксиды, активными компонентами которых являются радикалы –ОН, -Н, НО 2 -, образующиеся из пероксидов при воздействии таких факторов как кислород, вода, ультрафиолет, видимый свет;
аналоги метаболитов, механизм действия которых состоит в конкуренции с обычными метаболитами и их замещении. Это, напр., производные пуриновых и пиримидиновых оснований – бромурацил, аминопурин, а также производные витаминов, напр., фолиевой кислоты и т.д.;
недостаточно изученные вещества, механизм действия которых не вполне ясен.
В завершение следует также подчеркнуть, что ионизирующие излучения, ультрафиолет и химические мутагены вызывают образование мутаций, которые наиболее полно проявляются в зиготе второго поколения, если они произошли в генеративных клетках. Этот феномен получил название явления отсроченных мутаций.
КОМПЛЕКСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ
Исследование влияния отдельных факторов внешней среды на наследственную изменчивость раскрывает лишь некоторые стороны их влияния на мутационный процесс. Гораздо более сложную картину для интерпретации представляют результаты по комплексному воздействию сразу нескольких факторов, что обычно имеет место в природе. Поэтому для оценки вклада каждого из факторов ставят специальные эксперименты таким образом, чтобы в одной серии опытов варьировал в относительно широких пределах только один из факторов, а другие оставались примерно на том же уровне. Полученные результаты обрабатывают с помощью специальных статистических методов, которые позволяют оценить вклад каждого в отдельности из факторов в мутационный процесс.
Напр., в опытах на арабидопсисе изучали взаимодействие ультрафиолета и видимого света на мутационный процесс у ряда генетических форм этого растения. В качестве оценочной характеристики использовали показатель – выживаемость растений. В экспериментах варьировали мощность и продолжительность действия ультрафиолета, а также восстановительные свойства видимого света. Было установлено, что устойчивость растений к губительному действию ультрафиолета на 22% определяется особенностями генотипа и на 18% интенсивностью видимого света (ФАР – фотосинтетически активной радиации).
Особое значение подобные эксперименты представляют с точки зрения прогнозирования последствий, вызываемых воздействием факторов на биоценозы, для которых на основании полученных результатов могут быть построены теоретические модели. Это даёт возможность не только предвидеть негативные события в ценозе, но и главное – позволит формулировать реальные пути их предотвращения в целях сохранения биосферы Земли в целом или отдельных составляющих её компонентов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАГЕНЕЗА В ЦЕЛЯХ СЕЛЕКЦИИ
Открытие искусственного (индуцированного) мутагенеза нашло практическое применение в селекции несколько позже (с 50-х годов ХХ века), когда стали ясны некоторые механизмы этого процесса и разработаны методы отбора мутантов. Получение радиационных и химических мутантов сельскохозяйственных растений позволило получать ценные сорта, обладающие целым комплексом положительных свойств: устойчивостью к полеганию, болезням, низким температурам, повышенной хозяйственной продуктивностью и т.д.
Особое значение индуцированный мутагенез приобрёл в селекции микроорганизмов. Фактически вся микробиологическая промышленность по производству антибиотиков, аминокислот, витаминов и т.п. построена на использовании радиационных, химических и «ультрафиолетовых» мутантов.
Важные мутанты были получены у тутового шелкопряда, производящего натуральный шёлк.
1. Мутагенная роль химических веществ
2. Действие излучения
3. Закон гомологических рядов
1. Открыты сотни химических мутагенов. Некоторые из них усиливают мутагенный эффект во много раз по сравнению со спонтанными и называются супермутагенами. В экспериментах мутации индуцируются разнообразными химическими агентами. По-видимому, и в естественных условиях подобные факторы служат причиной появления спонтанных мутаций у различных организмов, в том числе у человека. Доказана мутагенная роль различных химических веществ и даже некоторых лекарственных препаратов, что говорит о необходимости изучения мутагенного действия новых фармакологических веществ и других химических соединений, широко используемых в медицине и сельском хозяйстве. Химические мутагены обладают тремя качествами :
Высокой проникающей способностью;
Свойством изменять коллоидное состояние хромосом;
Определенным действием на состояние гена или хромосомы.
2. Индуцированные мутации, вызванные облучением (радиацией),
впервые были обнаружены советским ученым Г.А. Надсоном. Для вызывания искусственных мутаций часто используются гамма-лучи, источником которых может быть, например, радиоактивный кобальт. Облучение индуцирует как генные мутации, так и структурные хромосомные перестройки всех описанных выше типов - нехватки, инверсии, удвоения и т. д. Все структурные изменения связаны с разрывом хромосом. Причиной этого являются некоторые особенности процессов, происходящих в тканях при действии излучения. Жесткие излучения вызывают в тканях ионизацию, в результате которой :
Одни атомы теряют электроны;
Другие присоединяют их;
Образуются положительно или отрицательно заряженные ионы. Подобный процесс внутримолекулярной перестройки, если он происходит в хромосомах, может привести к их фрагментации. Доказано, что связь между облучением и мутационными изменениями может носить и непрямой характер. По-видимому, энергия излучения может вызывать в среде, окружающей хромосому, химические изменения, которые ведут к индуцированию генных мутаций и структурных перестроек в хромосомах. Одно из самых опасных последствий облучения - образование свободных радикалов ОН или НО2 при радиолизе воды, находящейся в тканях. Эти радикалы обладают высокой реакционной способностью и могут воздействовать на многие органические вещества, в том числе нуклеиновые кислоты.
3. Многообразие мутирования подчиняется определенным закономерностям, которые впервые были обнаружены в 1920 г. Н.И. Вавиловым. При сравнении признаков различных сортов культурных растений и близких к ним диких видов обнаружилось много общих наследственных изменений, что позволило Вавилову сформулировать закон гомологических рядов в наследственной изменчивости: "Виды и роды, генетически близкие, характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости с такой правильностью, что, зная ряд форм в пределах одного вида, можно предвидеть существование параллельных форм у других видов и родов". Вавилов указывал, что гомологические ряды часто выходят за пределы родов и даже семейств.
Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости имеет прямое отношение к изучению наследственных болезней у человека. Вопросы лечения и профилактики наследственных заболеваний не могут быть решены без широкомасштабных исследований на животных с наследственными аномалиями.
Согласно закону Вавилова, мутации, аналогичные наследственным болезням человека, должны встречаться у животных. Так, у собак наблюдается гемофилия, сцепленная с полом. Альбинизм зарегистрирован у многих видов грызунов, кошек, собак и птиц. Моделями для изучения мышечной дистрофии могут служить мыши и крупный рогатый скот, эпилепсии - кролики и крысы, аномалий в строении глаз - многие виды грызунов, собаки и свиньи. Наследственная глухота обнаруживается у морских свинок, мышей и собак. Аномалии, аналогичные заячьей губе и волчьей пасти, бывают у мышей, собак, свиней.
Действие мутагенов на наследственные структуры клеточного ядра неодинаково, поэтому возникают различные мутации трех типов , вызванные изменением количества хромосом, изменением структуры хромосом и изменением структуры гена (прилож. 1).
Мутации также разделяются на морфологические, физиологические и биохимические . Они могут изменять проявление любого внешнего признака, влиять на функции отдельных органов, рост и развитие организма, вызывать различные изменения химического состава клеток и тканей.
По проявлению мутации бывают доминантные и рецессивные , при этом рецессивные мутации возникают значительно чаще, чем доминантные. Мутационный процесс, как правило, идет от доминантности к рецессивности. Доминантные мутации проявляются сразу же в гетерозиготном состоянии, рецессивные – только тогда, когда мутированный ген окажется в гомозиготном состоянии.
По относительному влиянию на жизнеспособность и плодовитость организма мутации делятся на полезные , нейтральные и вредные . Полезные мутации повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды (к повышенной или пониженной температуре, возбудителям болезней и т. д.). Вредные мутации задерживают рост, развитие, вызывают гибель организма. Летальные мутации бывают доминантные , которые проявляются в первом поколении и быстро удаляются из популяции естественным отбором, и рецессивные , которые накапливаются в генотипе и проявляются в последующих поколениях.
Совокупность всех мутаций, возникающих у организма под действием мутагенного фактора, называют спектром мутаций . Большое разнообразие мутаций указывает на широкий спектр мутагенеза, а однотипные мутации – на узкий спектр.
Мутационная изменчивость происходит на разных этапах развития организма и во всех его клетках. Мутации, возникающие в половых клетках в гаметах и клетках, из которых образуются организмы, называются генеративными . Мутации, возникающие в соматических клетках организма, называются соматическими . По своей природе генеративные и соматические мутации ничем не отличаются, так как их возникновение связано с изменением структуры хромосом, и образуются они примерно с одинаковой частотой. Однако, по характеру проявления и значимости для эволюции и селекции различия между этими видами мутаций очень существенны. Генеративные мутации при половом размножении передаются следующим поколениям организмов. При этом доминантные мутации проявляются уже в первом поколении, а рецессивные – только во втором и последующих поколениях при переходе их в гомозиготное состояние. Соматические мутации возникают в диплоидных клетках, поэтому проявляются только по доминантным генам или по рецессивным генам в гомозиготном состоянии. Они имеют большое значение для эволюции организмов с вегетативным размножением.
Все мутации по степени их фенотипического проявления делят на два класса : крупные (или видимые) и малые . Крупные мутации легко обнаруживаются по появлению различных наследственных морфологических аномалий. Малые мутации проявляются через незначительные изменения физиологических, морфологических и любых количественных признаков. Крупные мутации выделяют путем отбора отдельных измененных растений во втором мутантном поколении (М 2). Малые мутации выявляют в результате математической обработки данных изменчивости изучаемого признака по семьям растений в третьем мутантном поколении (М 3). Благодаря малым мутациям создается огромная наследственная изменчивость различных признаков в популяциях растений, что имеет большое значение в селекции и эволюции вида. Крупные мутации, за редким исключением, не дают начала новым сортам и видам, потому что по причине низкой адаптации к внешним условиям удаляются естественным отбором.
От мутаций следует отличать морфозыили фенотипическое проявление признаков, которые являются одной из форм ненаследственной индивидуальной изменчивости организма, поэтому в последующих поколениях они не проявляются.
Для получения хозяйственно-ценных мутаций облучают от 2 до 4 тысяч семян. Отбор мутаций чаще всего проводят в М 2 . В связи с тем, что в М 2 выявляются не все мутации, отбор проводят и в М 3 . Иногда отбор мутаций начинают проводить в М 1 , при этом отбирают доминантные мутации по интересующему признаку (например, высокопродуктивные растения) для последующего отбора всех полезных мутаций. Для ускорения и облегчения выделения полезных мутаций все выделенные в М 1 растения высевают как индивидуальные потомства отдельных растений (семьи) для получения второго мутантного поколения. В М 2 отбирают мутанты с хорошо выраженными хозяйственно-ценными признаками и растения для получения малых мутаций в М 3 . В дальнейшем из ценных мутантов формируются новые улучшенные популяции, их используют в селекции (при скрещивании друг с другом или с другими сортами). Эффективность селекции повышается при обязательном экологическом испытании мутантов.
Радиационная селекция, как метод получения новых ценных сортов сельскохозяйственных растений и высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, широко используется в практике. Радиационная селекция в растениеводстве включает два этапа :
1) использование ионизирующего излучения для получения селекционно-ценных мутантных форм растений, которые используются в дальнейшем в селекционном процессе в качестве исходного материала;
2) включение мутантных форм растений в селекционную работу по созданию новых сортов, обладающих селекционно-ценными признаками мутантных форм.
Для получения мутантов в растениеводстве используют рентгеновское излучение и гамма-излучение, нейтронное излучение (быстрые нейтроны – 0,2-26 МэВ и медленные нейтроны – 0,025 МэВ) и радиоактивные изотопы (фосфор-32 и серу-35) и др. Вероятность возникновения мутаций при облучении различных биологических объектов возрастает с увеличением поглощенной дозы. Однако, с увеличением дозы возрастает и гибель особей в облученной популяции, при этом многие возникшие мутации не выявляются. При радиационной селекции растений часто используют дозы, при которых погибает 70 % растений. Эти дозы называются критическими . У 30 % выживших растений можно наблюдать большое количество мутаций различного характера. Наиболее часто хозяйственно ценные мутанты образуются при меньших дозах облучения, при которых погибает только 20-30 % растений. Величина дозы облучения зависит от радиочувствительности биологических объектов. Например, дозы облучения семян рентгеновским и гамма-излучением для выхода полезных мутаций у пшеницы, ячменя и кукурузы составляют 50- 100 Гр, у овса – 70-100 Гр, у люпина – 140-160 Гр.
Под действием ионизирующего излучения возникают генные (или точечные) мутации и хромосомные мутации (или геномные мутации) . Геномные мутации , сопровождающиеся уменьшением количества хромосом (анеуплоидия) и увеличением количества хромосом (полиплоидия) в 2 или 4 раза наблюдаются редко. Анеуплоидные формы растений имеют резкие морфологические дефекты и не представляют интереса для радиационной селекции. Полиплоидные формы растений несут летальные мутации, поэтому погибают. Для селекционной работы жизнеспособные полиплоидные формы растений получают с использованием метода химического мутагенеза, при этом в качестве мутагенного препарата часто используют колхицин. Для радиационной селекции наибольший интерес представляют генные мутации. Следует напомнить, что ген – это определенный участок молекулы ДНК. Генные мутации индуцируются в пуриновых и пиримидиновых основаниях молекулы ДНК при ее радиолизе, что приводит к изменению генетического кода и, в конечном итоге, к появлению новых признаков, сформированных под действием облучения. В образовании мутаций немаловажную роль играют также процессы репарации одиночных разрывов молекулы и процессы репарации повреждений оснований.
Выход радиационных мутаций зависит от величины дозы облучения, мощности дозы облучения, вида излучения и величины линейной передачи энергии (ЛПЭ) и от стадии онтогенеза растений. Частота возникновения мутаций возрастает пропорционально дозе облучения. Однако, с увеличением дозы увеличивается частота хромосомных аберраций и гибель клеток, поэтому возникшие мутации не выявляются. Абсолютная величина дозы зависит от радиочувствительности конкретного облучаемого организма. Часто хозяйственно полезные мутанты растений образуются при облучении семян дозой, вызывающей гибель 20-30 % растений.
Возникновение мутаций, как и любого радиобиологического эффекта, – это многостадийный процесс, в котором участвуют, с одной стороны, вещества, повышающие выход мутаций, а, с другой стороны, ферменты репарации, снижающие выход мутаций. При большой мощности дозы облучения образуется больше мутаций, потому что при малой мощности дозы уже в процессе облучения успевают произойти репарационные процессы. При хроническом облучении развивающихся растений (при малой мощности дозы), растения облучаются в разных по радиочувствительности фазах развития, поэтому спектр мутаций разнообразнее, или при облучении растений в конкретной стадии развития высокой мощностью дозы. С уменьшением мощности дозы снижается количество хромосомных нарушений, поэтому уменьшается гибель клеток и растений.
Установлено, что при облучении излучением с низкой ЛПЭ (рентгеновское и гамма-излучение), большинство хромосомных повреждений восстанавливаются. Среди мутантных растений выявляют формы с признаками устойчивости к болезням, повышенного содержания ценных веществ. Излучения с высокой ЛПЭ (нейтроны) вызывают более глубокие нарушения в хромосомах, которые не восстанавливаются, поэтому у выживших мутантных растений выявляются многообразные нарушения морфологических признаков.
Выход и качество мутаций зависит не только от физических свойств излучений, но и от состояния генома как в момент облучения, так и в пострадиационный период окончательного формирования мутации. В радиационной селекции растений наиболее часто облучают покоящиеся воздушно-сухие семена растений. Облучение семян в различные периоды формирования, начиная с момента образования оплодотворенной семяпочки и до состояния глубокого покоя, дает неидентичные результаты. Частота и эффективность мутаций значительно возрастает при облучении растений в период слияния половых гамет и образования зиготы, в фазе завершения формирования зародыша и в фазе усиления ростовых процессов зародыша при прорастании семени.
Для получения мутантных растений используют метод облучения пыльцы в период ее созревания с последующим искусственным опылением необлученных растений облучаемой пыльцой.
Хозяйственно полезные мутанты растений, сочетающие высокую продуктивность с другими признаками, появляются, как правило, очень редко. Селекционно-ценные мутантные формы растений выделяются содержанием питательных веществ, скороспелостью, устойчивостью к болезням, устойчивостью к полеганию, повышенной продуктивностью и другими признаками. Мутантные формы используются в качестве донора полезного признака в селекции растений . На основе радиационного мутагенеза в растениеводстве решаются вопросы получения новых сортов сельскохозяйственных растений, которые характеризуются высокой урожайностью, устойчивостью к неблагоприятным условиям среды и действию патогенных вредителей. Селекционеры, используя мутагенный эффект, гамма-облучения почти в 5 раз сокращают сроки выведения новых сортов зерновых культур.
К настоящему времени зарегистрировано более 1000 сортов различных растений, созданных с использованием мутантных форм растений, полученных при использовании ионизирующих излучений. Больше всего таких сортов получено у ячменя (72 сорта), риса (65 сортов), пшеницы (38 сортов), фасоли (10 сортов), арахиса (15 сортов), в которых сочетается высокая урожайность и улучшенное качество зерна с высокой экологической пластичностью. У декоративных растений получено более 500 радиационных мутантов, отличающихся прекрасными декоративными формами, устойчивостью к болезням и хорошей адаптационной способностью к неблагоприятным факторам внешней среды.
В микробиологической практике обычно используют дозы, при которых остается 1-5 % выживших микроорганизмов. Радиационным методом был получен штамм микроорганизма для производства молочного порошка нислактин, при добавлении которого к плавленым сырам улучшается их качество и продлевается срок хранения. Нислактин используют в кормовых добавках при вскармливании поросят, при этом повышается прирост массы поросят и улучшается их общее состояние. Методом радиационной селекции были получены новые формы микроорганизмов, которые являются возбудителями заболеваний у ряда вредителей сельскохозяйственных культур. Например, был получен возбудитель мускардиноза для более 60-ти видов насекомых-вредителей (яблоневой плодожорки, хлебного клопа-черепашки, фасолиевой зерновки и др). Особый интерес и практическую ценность при радиационных мутациях микроорганизмов представляют генные мутации, которые косвенно влияют на деятельность ферментов. При этом фермент активизируется, и реакции, катализируемые этим ферментом, проходят интенсивнее, чем в норме, поэтому у микроорганизмов усиливается продукция того и иного метаболита – антибиотиков, аминокислот и др.
При облучении культуры дрожжей были получены расы, вырабатывающие в 2 раза больше эргостерина, что имеет большое значение для витаминной промышленности.
Комбинированным воздействием радиации и химических мутагенов получено много штаммов высоко активных плесневых грибов, которые вырабатывают пенициллин, стрептомицин, ауреомицин, эритромицин и альбомицитин. Некоторые штаммы плесневых грибов дают выход стрептомицина в 20, а пенициллина в 50 раз больше исходных рас. Производство антибиотиков промышленным способом значительно расширило их доступность для населения.
Оглавление темы "Генетические элементы бактерий. Мутации у бактерий. Трансдукция.":Химический мутагенез . Некоторые химические вещества (мутагены ) значительно повышают частоту мутирования до одной мутантной клетки на 103-104 клеток. К таким веществам относят аналоги азотистых оснований (например, бромурацил), включающиеся в молекулу ДНК и вызывающие вставку некорректного основания при репликации (в частности, бромурацил аналогичен по структуре тимину, он включается в ДНК как партнёр аденина, а затем переходит в энольную форму и узнаётся полимеразой как цитозин, что приводит к включению гуанина вместо аденина); алкилирующие агенты (например, этилметансульфонат алкилирует преимущественно атом азота гуанина); азотистая кислота, дезаминирующая азотистые основания; интеркалирующие агенты (например, акридиновые красители), внедряющиеся между основаниями ДНК и вызывающие увеличение расстояния между ними, что приводит к утрате нуклеотидов, включению дополнительной пары нуклеотидов и др.
Радиационный мутагенез обычно приводит к образованию пиримидиновых димеров. УФ-, рентгеновские лучи и другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы как летальное (подавляющее жизнедеятельность), так и мутагенное воздействие.
Мутации могут индуцировать следующие события: модификации оснований (изменения отдельных нуклеотидов), вставки (включение дополнительных оснований), делении (потеря одного основания или группы оснований) и деформации спирали ДНК.
Модификация оснований включает химическое изменение азотистого основания в кодирующей последовательности, что приводит к изменению кодона. В результате вместо одной аминокислоты кодируется другая либо возникает бессмысленный кодон.
Вставка либо делеция какого-либо оснований (аналогов оснований) в ДНК приводит к фреймшифт-мутациям (мутации со сдвигом рамки считывания), что вызывает изменение позиции рамки считывания триплетного кодона, и, таким образом, изменение всех последующих кодонов.
Деформации спирали ДНК (структурные искажения ДНК) образуются в результате индуцированной УФ-излучением димеризации расположенных близко нуклеотидов (особенно тимина). Образовавшееся циклобутановое кольцо нарушает симметрию ДНК и препятствует правильной репликации. Репликация может быть нарушена также при образовании поперечных межцепочечных сшивок ДНК. Б зависимости от синтеза «правильных» или «неправильных» полипептидов при считывании мРНК, отразившей изменения ДНК (то есть в зависимости от сохранения смысловой функции образующегося полипептида), различают несколько видов мутаций .
«Молчащие» мутации (мутации «без изменения смысла», то есть не вызывающие изменения аминокислотной последовательности белка). Их появление возможно вследствие вырожденности генетического кода. Получившийся в результате мутирования триплет кодирует ту же самую аминокислоту, что и исходный триплет, поэтому синтезируемый белок остаётся без изменений.
Миссенс-мутации (мутации «с изменением смысла») возникают при условии, что изменения кодирующей последовательности приводят к появлению в полипептиде иной аминокислоты. Получающийся изменённый белок может быть функциональным или нефункциональным в зависимости от значимости затронутой мутацией области.
Нонсенс-мутации («антисмысловые», «бессмысленные» мутации) приводят к образованию одного из трёх кодонов-терминаторов (УАГ, УАА, УГА), вызывающих преждевременное окончание синтеза полипептидной цепи. Когда рибосома достигает такого кодона, процесс элонгации полипептидной цепи заканчивается, и высвобождается неполный пептид (вероятно, такое действие терминальных кодонов обусловлено отсутствием тРНК, связывающихся с данными кодонами). Эта мутация приводит либо к синтезу очень коротких нефункциональных белков, либо к полному прекращению синтеза белка.
